H. Identifikasi Golongan Senyawa Ekstrak
Tahap selanjutnya dilakukan identifikasi senyawa menggunakan berbagai reagen semprot. Tujuan dari pengujian identifikasi golongan senyawa ekstrak
adalah mengetahui golongan senyawa yang terdapat dalam hasil pemisahan ekstrak menggunakan beberapa reagen. Hasil identifikasi golongan senyawa
ekstrak dapat dilihat pada data dibawah ini.
Gambar 10. Hasil identifikasi golongan senyawa hasil pemisahan ekstrak pada
berbagai reagen semprot A= alumunium chloride ; B= Dragendorff; C= ferric
chloride ; D= Sitroborat ; E= Vanilin Sulfat
Tabel XI. Hasil identifikasi golongan senyawa hasil pemisahan ekstrak pada
berbagai reagen
Rf Sitroborat
Dragen dorff
AlCl
3
FeCl
3
Vanilin Sulfat
Interpretasi Hasil
0,10 - 0,15 -
- -
- -
- 0,20 - 0,25
- -
- -
- -
0,35 - 0,40 Berpendar +
- Berpendar
++ -
- Flavonoid
0,45 - 0,55 -
- -
- -
- 0,60 - 0,65
- -
- -
- -
0,70 - 0,76 Berpendar +
- Berpendar
+++ -
Ungu ++
Flavonoid dan
terpenoid 0,76 - 0,80
- -
- -
- -
Bercak pada Rf 0,35 - 0,40 dan 0,70 - 0,76 berpendar biru kehijauan pada deteksi UV 366 nm setelah diuji dengan reagen alumunium chloride dan
sitroborat. Dengan demikian bercak pada Rf tersebut terdapat senyawa golongan flavonoid. Reagen alumunium chloride dan sitroborat merupakan reagen yang
memiliki mekanisme memperjelas warna bercak sehingga dapat dideteksi. alumunium chloride
akan membentuk kompleks senyawa yang dapat berfluoresensi dengan flavonoid sehingga akan berpendar lebih terang pada
deteksi dengan UV 366 nm. Bercak yang semula tidak tampak, akan menjadi lebih terlihat dengan adanya reaksi dengan alumunium chloride ini Markham,
1988.
Gambar 11. Reaksi antara
alumunium chloride dengan senyawa flavonoid membentuk kompleks senyawa yang berfluoresensi lebih terang Jork, Funk,
Fischer, dan Wimmer, 1990.
Bercak pada Rf 0,70 - 0,76 menunjukkan hasil positif bila diuji dengan reagen vanilin sulfat. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu yang
menunjukkan adanya senyawa golongan terpenoid pada bercak tersebut. Fungsi pemanasan pada suhu 100ºC dan penambahan asam sulfat sebagai pelarut dari
vanilin adalah untuk mempercepat reaksi yang terjadi. Warna ungu yang terbentuk pada penambahan reagen vanilin sulfat
menunjukkan adanya senyawa terpenoid. Selain digunakan untuk mendeteksi terpenoid, reagen ini dapat digunakan untuk mendeteksi flavonoid, asam lemak,
dan kardenolida aglikon Jork, Funk, Fischer, dan Wimmer, 1990.
I. Penghilangan Klorofil Ekstrak Bunga Kenanga dengan Karbon Aktif
Adanya klorofil yang ikut terelusi pada hasil pemisahan senyawa dengan fase gerak kloroform : metanol 95 : 5 vv ditunjukkan dengan adanya bercak
berpendar berwarna merah yang dideteksi pada UV 366 nm. Klorofil merupakan senyawa yang dapat menjadi pengotor saat proses isolasi serta senyawa yang akan
menjadi pengganggu saat analisis uji aktivitas. Karena alasan tersebut maka dilakukan penghilangan klorofil menggunakan karbon aktif. Hasil penghilangan
klorofil dapat dilihat pada gambar dibawah ini.
Gambar 12. Hasil penghilangan klorofil dengan karbon aktif A= deteksi pada UV 254 nm dan B= deteksi pada UV 366 nm
Target isolasi adalah bercak dengan Rf 0,70 - 0,76 dan bercak ini tertutup oleh bercak klorofil yang terletak pada Rf yang sama. Klorofil merupakan
senyawa yang berukuran lebih besar dibandingkan dengan metabolit-metabolit sekunder lain yang ada pada bahan alam. Karena ukurannya yang relatif besar
maka dengan adanya karbon aktif, klorofil akan terikat dan akan mengendap bersama karbon aktif sehingga dapat dipisahkan dari metabolit sekunder yang
akan dianalisis. Hasil pada gambar menunjukkan bahwa usaha penghilangan
klorofil dengan karbon aktif berjalan baik. Hal ini tampak pada intensitas warna merah yang berkurang saat hasil pemisahan dideteksi pada UV 366 nm.
J. Kromatografi Kolom
Ekstrak hasil pembersihan klorofil 0,3179 g
Isolat aktif aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri
Kromatografi kolom : -
Optimasi fase gerak -
Kromatografi kolom step gradien
KLT hasil kromatografi kolom
Uji aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan
antibakteri Isolat 1
0,021 g Isolat 2
0,0036 g Isolat 3
0,002 g
Sebelum melakukan isolasi senyawa menggunakan kromatografi kolom, terlebih dulu dilakukan optimasi fase gerak. Optimasi fase gerak dilakukan
menggunakan 4 jenis fase gerak dimulai dari yang bersifat nonpolar hingga polar. 4 jenis fase gerak tersebut adalah n-heksana : kloroform 50 : 50 vv, n-heksana :
kloroform 25 : 75 vv, kloroform, dan kloroform : metanol 98 : 2 vv. Tujuan dilakukan optimasi fase gerak adalah untuk mengetahui kisaran polaritas fase
gerak yang akan digunakan untuk memulai tahapan kromatografi kolom. Hasil optimasi fase gerak untuk kromatografi kolom dapat dilihat pada gambar dibawah
ini.
Gambar 13. Hasil optimasi fase gerak kromatografi kolom gradien A= deteksi
pada UV 254 nm; B= deteksi pada UV 366 nm; 1 = n-heksana : kloroform 50 : 50 vv; 2 = n-heksana : kloroform 25 : 75 vv; 3 = kloroform; 4 = kloroform : metanol
98 : 2 vv
Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa semakin naik polaritas fase gerak maka Rf bercak yang terelusi akan semakin naik. Dengan fase gerak n-heksana :
kloroform 50 : 50 vv dapat dilihat bahwa setidaknya ada 2 bercak yang mulai terelusi. Untuk memulai tahapan isolasi dengan kromatografi kolom, maka
peneliti menggunakan fase gerak n-heksana : kloroform 70 : 30 vv yang bersifat lebih nonpolar daripada fase gerak yang digunakan saat optimasi dengan harapan
bahwa senyawa akan terelusi lebih bertahap sehingga akan membuat hasil kromatografi kolom lebih optimal.
Tabel XII. Optimasi fase gerak kromatografi kolom
Fase gerak Rf
UV 254 UV 366
n-heksana : kloroform 50 : 50
vv 0,10
Meredam -
n-heksana : kloroform 25 : 75
vv 0,16
Meredam -
0,66 Meredam
- kloroform
0,23 Meredam
- 0,70
Meredam -
kloroform : metanol 98 : 2 vv
0,44 Meredam
- 0,74
Meredam -
Berdasarkan panduan uji aktivitas yang telah dilakukan, diambil kesimpulan bahwa senyawa kimia pada bercak dengan Rf 0,70 - 0,76 merupakan
target isolasi karena memiliki aktivitas penangkap radikal DPPH, UV protection, dan antibakteri. Selain itu bercak pada Rf ini terlihat lebih tebal daripada bercak
yang lain yang artinya komponen senyawa yang terdapat pada bercak ini kelimpahannya paling tinggi dibandingkan komponen senyawa pada bercak yang
lain.Isolasi dilakukan dengan teknik kromatografi kolom step gradien. Prinsip dari teknik ini adalah elusi senyawa pada kolom kromatografi dengan polaritas fase
gerak yang ditingkatkan secara bertahap. Bila dibandingkan dengan bercak yang lain, bercak pada Rf 0,70 - 0,76
bersifat paling nonpolar dilihat dari nilai Rf yang dihasilkan. Proses isolasi dengan kromatografi kolom step gradien akan mudah dilakukan bila mengisolasi senyawa
yang sifatnya relatif nonpolar. Proses isolasi dilakukan menggunakan urutan fase gerak sebagai berikut: N-heksana : kloroform 70 : 30 vv, n-heksana : kloroform
60 : 40 vv, n-heksana : kloroform 50 : 50 vv, n-heksana : kloroform 40 : 60 vv, kloroform, dan kloroform : metanol 90 : 10 vv. Setiap komponen fase
gerak yang digunakan untuk mengelusi ditambahkan sebanyak 5 mL. Setiap 2 mL hasil elusi kolom ditampung dalam tabung untuk selanjutnya dilakukan
pengecekan dengan KLT menggunakan fase gerak kloroform : metanol 95 : 5 vv.
Gambar 14. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 1 menggunakan fase
gerak kloroform : metanol 95 : 5 vv A = deteksi pada UV 254 nm; B = deteksi pada UV 366 nm
Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa ada 10 bercak yang memiliki Rf pada rentang 0,70 - 0,76. Pemisahan pada Rf yang terlalu tinggi menyebabkan
resolusi pemisahan kurang baik, maka dilakukan elusi untuk tabung pada nomor 1 sampai 9 menggunakan fase gerak n-heksana : kloroform 50 : 50 vv untuk
menurunkan nilai Rf yang dihasilkan. Tabung nomor 10 tidak diuji karena dekat dengan nomor tabung dimana klorofil mulai muncul dengan pekat. Klorofil mulai
muncul kembali dengan pekat pada tabung nomor 11. Tampak pada gambar bahwa klorofil sudah bersih dari bercak yang merupakan target isolasi. Untuk
pengecekan hasil kolom proses 2 dan proses 3 cara yang digunakan sama dengan cara tersebut. Karena target isolasi adalah bercak dengan Rf 0,70 - 0,76 maka
pada proses 2 dan proses 3 yang dielusi ulang menggunakan fase gerak n-heksana : kloroform 50 : 50 vv adalah bercak yang memiliki Rf tersebut.
Tabel XIII. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 1 dengan fase gerak n-
heksana : kloroform 50 : 50 vv
Tabung Rf
Visual UV 254
UV 366 1
0,75 -
Meredam -
2 0,62
- Meredam
- 0,75
- Meredam
- 3
0,62 -
Meredam -
4 0,62
- Meredam
- 5
0,42 -
Meredam -
6 0,42
- Meredam
- 7
0,37 -
Meredam -
8 0,34
- Meredam
- 9
0,31 -
Meredam -
Tabel XIV. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 2 dengan fase gerak n-
heksana : kloroform 50 : 50 vv
Tabung Rf
Visual UV 254 nm
UV 366 nm 1
0,74 -
Meredam -
2 -
- -
- 3
0,60 -
Meredam -
4 0,57
- Meredam
- 5
0,52 -
Meredam -
6 -
- -
- 7
- -
- -
8 -
- -
- 9
- -
- -
10 0,31
- Meredam
- 11
0,31 -
Meredam -
Tabel XV. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 3 dengan fase gerak n-
heksana : kloroform 50 : 50 vv
Tabung Rf
Visual UV 254
UV 366 1
0,74 -
Meredam -
2 0,60
- Meredam
- 3
0,57 -
Meredam -
4 0,54
- Meredam
- 5
0,48 -
Meredam -
6 0,48
- Meredam
- 7
- -
- -
8 -
- -
- 9
0,31 -
Meredam -
10 0,31
- Meredam
- 11
0,20 -
Meredam -
Setelah dilakukan kromatografi kolom sebanyak 3 kali, dilakukan pengumpulan dan pemekatan isolat menggunakan tangas air. Bercak yang
memiliki Rf yang mirip pada elusi dengan fase gerak n-heksana : kloroform 50 : 50 vv pada tiap proses dikumpulkan dan dipekatkan dan didapatkan 10 isolat
yang mendekati murni secara KLT.
Tabel XVI. Penggabungan isolat hasil kromatografi kolom
Isolat Tabung
Rendemen bb
Proses 1 Proses 2
Proses 3 1
1 1
1 6,61
2 3, 4
3 2
1,13 3
- 4
3 0,63
4 -
5 4
0,19 5
5, 6 -
- 0,06
6 9
10, 11 9, 10
0,13 7
7 -
- 0,03
8 8
- -
0,03 9
- -
5, 6 0,16
10 -
- 11
0,03 Berdasarkan hasil penimbangan, didapatkan 3 isolat yang diperkirakan
merupakan major compound pada bercak dengan Rf 0,70 - 0,76. 3 isolat yang merupakan major compound adalah isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 yang memiliki
jumlah rendemen yang relatif lebih banyak daripada isolat lain. Selanjutnya ketiga isolat inilah yang akan dilanjutkan dengan uji kualitatif penangkap radikal bebas
DPPH, UV protection, dan antibakteri.
K. Hasil Deteksi Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3
Pada tahap ini dilakukan deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV 366 nm. Tujuannya adalah untuk melihat karakteristik isolat yang
didapatkan pada proses isolasi. Hasil deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 dapat dilihat pada gambar dibawah ini.
Gambar 15. Deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV 366
nm A1= deteksi isolat 1 pada UV 254 nm; A2= deteksi isolat 1 pada UV 366 nm; B1= deteksi isolat 2 pada UV 254 nm; B2= deteksi isolat 2 pada UV 366 nm; C1=
deteksi isolat 3 pada UV 254 nm; C2= deteksi isolat 3 pada UV 366 nm
Tabel XVII. Hasil deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV
366 nm pada sistem fase gerak kloroform : metanol 95 : 5 vv
Isolat Rf
Visual UV 254 nm
UV 366 nm 1
0,70 - 0,76 -
Meredam Biru menyala
++++ 2
0,70 - 0,76 -
Meredam Biru menyala +
3 0,70 - 0,76
- Meredam
-
Kategori