Keuntungan metode bioautografi dibandingkan metode yang lain adalah dapat digunakan untuk mengetahui secara langsung aktivitas biologi dari hasil
pemisahan senyawa yang kompleks, cepat, mudah, dan murah untuk dilakukan. Selain itu interpretasi hasilnya juga mudah dan akurat Kusumaningtyas, 2008.
3. Metode difusi
Salah satu metode difusi yang biasa dilakukan untuk menentukan aktivitas antimikroba adalah dengan menggunakan cakram disc. Zat yang akan diuji
ditampung dalam cakram kertas yang ditempelkan pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri uji. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada waktu dan suhu
tertentu sesuai persyaratan dan kondisi optimum mikroba uji. Hasil positif ditandai dengan adanya zona penghambatan berupa daerah bening di sekitar
cakram kertas Pelczar dan Chan, 1988. Prinsip penentuan aktivitas antimikroba dengan metode difusi adalah
kemampuan difusi dari zat uji pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri tertentu. Hasil positif ditandai dengan adanya zona hambatan di sekeliling zat
yang diuji setelah dilakukan inkubasi selama waktu tertentu Brooks, Butel, Carrol, dan Morse, 2007.
F. Kromatografi
1. Kromatografi lapis tipis KLT
Kromatografi Lapis Tipis KLT adalah suatu bentuk kromatografi planar. Pada KLT fase diam yang ada berupa lapisan yang seragam pada permukaan
bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat
plastik. Fase gerak akan bergerak sepanjang fase diam diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik ascending, atau karena pengaruh
gravitasi pada pengembangan secara menurun descending Gandjar dan Rohman, 2007.
Pemisahan pada KLT akan optimal apabila penotolan sampel dilakukan dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin sehingga menghasilkan
resolusi yang baik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan manual bila jumlah sampel lebih dari 15
μl. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak menyebar dan puncak ganda Gandjar dan Rohman, 2007.
Bercak hasil pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Oleh karena itu, beberapa cara yang dapat dilakukan untuk
mendeteksi bercak antara lain: 1.
Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan solut yang mempunyai gugus fungsi tertentu
sehingga bercak menjadi berwarna khas. 2.
Mengamati lempeng di bawah sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak
yang berfluorosensi terang pada dasar yang berfluoresensi seragam. 3.
Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrit pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik sehingga akan tampak bercak
hitam hingga kecoklatan.
