Pengaruh Curcuminoid terhadap Pajanan Bising yang Ditinjau dari Ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan Kolagen Tipe IV pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus (Studi Eksperimental Laboratorik Ex Vivo)

PENGARUH

CURCUMINOID

_{TERHADAP PAJANAN BISING}

YANG DITINJAU DARI EKSPRESI HSP-70, NF

κ

B, TLR-2,

TLR-4, MMP-9 DAN KOLAGEN TIPE IV PADA

FIBROBLAS KOKLEA

RATTUS NORVEGICUS

(STUDI EKSPERIMENTAL LABORATORIK EX VIVO)

DISERTASI

TENGKU SITI HAJAR HARYUNA

NIM 098102008

PROGRAM STUDI DOKTOR (S3) ILMU KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

DAFTAR RIWAYAT HIDUP DATA PRIBADI

Nama : dr. Tengku Siti Hajar Haryuna, Sp.THT-KL

NIP : 19790620 200212 2 003

Tempat / Tanggal lahir : Medan / 20 Juni 1979 Pangkat / Golongan : Pembina / IVa

Jabatan : Lektor Kepala

Agama : Islam

Alamat Rumah : Jl. Jamin Ginting Km. 8.5 Komp. Royal Sumatera Kavling Doritis No. 198, Medan 20141

No.Telepon: 061-8360343 / HP: 08126061694 Alamat Kantor : SMF THT-KL / RSUP H. Adam Malik

Jl. Bunga Lau No. 17 Medan No. Telepon: 061-8365490 Alamat e-mail : dr_heydi@yahoo.com Instansi : Fakultas Kedokteran USU

Nama Orang Tua : 1. Ayah : Ir. Tengku Haris Aminullah

2. Ibu : Prof. Dr. Ir. Tengku Chairun Nisa, M.Sc Nama Suami : dr. Edwin Martin Asroel, Sp.OG

Nama Anak : Ramiza Alya Putri Edwina PENDIDIKAN FORMAL

Sekolah Dasar : SD Panca Budi Medan (tamat tahun 1989)

Sekolah Menengah Pertama : Sekolah Indonesia Kuala Lumpur (tamat tahun 1992) Sekolah Menengah Atas : SMA Immanuel Medan (tamat tahun 1995)

Sarjana : Fakultas Kedokteran USU Medan (tamat tahun 2002) Spesialisasi : Ilmu Kes. THT-KL, FK USU Medan (tamat tahun 2007) Doktoral : Ilmu Kedokteran, FK USU Medan (tamat tahun 2013) RIWAYAT PEKERJAAN

1. Staf Pengajar Tetap Departemen THT- KL FK USU/RSUP H. Adam Malik Medan (Desember 2002 s/d sekarang)

2. Ketua Program Studi Ilmu Kesehatan THT-KL FK USU (Januari 2011 s/d sekarang)

KEANGGOTAAN ORGANISASI PROFESI NASIONAL/INTERNASIONAL 1. Ikatan Dokter Indonesia (IDI) (Juli 2002 s/d sekarang)

2. Perhimpunan Dokter Spesialis Telinga Hidung Tenggorok-Bedah Kepala Leher Indonesia (PERHATI-KL) (Januari 2003 s/d sekarang)

Medan, April 2013

UCAPAN TERIMAKASIH

Dengan mengucap syukur Alhamdulillah segala puji dipanjatkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala yang telah melimpahkan karunia, rahmat, taufik dan hidayahNya, sehingga disertasi yang merupakan tugas akhir program S3 telah sampai pada tahap akhir. Perasaan bahagia dan lega dirasakan, semoga disertasi ini dan ilmu yang diperoleh dapat bermanfaat bagi masyarakat.

Banyak kendala dan kesulitan yang dihadapi dalam penulisan karya ilmiah ini dan juga pada saat melakukan penelitian. Disadari bahwa tanpa bantuan berbagai pihak, tugas ini tidak dapat dilaksanakan dengan baik, namun berkat bantuan dan bimbingan serta dorongan moril dari keluarga, tim promotor dan teman sejawat, akhirnya disertasi ini dapat diselesaikan. Maka dari itu dengan hati yang tulus dan penuh rasa syukur, terima kasih yang tak terhingga dan penghargaan yang setinggi-tingginya saya ucapkan kepada yang terhormat:

Prof. dr. Ramsi Lutan, Sp.THT-KL(K), sebagai Promotor yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan pikiran untuk membimbing dengan penuh kesabaran dan perhatian, memperluas wawasan keilmuan, memotivasi secara terus menerus, sehingga disertasi ini dapat terselesaikan. Saya kagum akan kearifan, kelapangan hati dan sikap yang selalu siap menolong dari beliau. Semoga Allah SWT selalu melimpahkan rahmat dan hidayahNya kepada beliau.

Dr. dr. Nyilo Purnami, Sp.THT-KL(K), sebagai Ko-Promotor I yang telah dengan ikhlas dan penuh kesabaran membimbing, memotivasi, membantu, memperluas wawasan keilmuan dan memberikan saran serta memberikan dukungan moril secara terus menerus, sehingga saya dapat menyelesaikan disertasi ini. Beliau mengajarkan saya tentang pentingnya memperhatikan aspek-aspek lainnya dalam kehidupan sehingga menambah makna dalam meningkatkan keilmuan, keprofesian, bermasyarakat dan berkeluarga. Saya sangat bangga dapat dibimbing oleh beliau yang benar-benar dapat menjadi panutan sebagai seorang

pendidik sejati dengan kedalaman dan keluasan ilmu beliau yang selalu memberikan ide-ide cemerlang dalam menyelesaikan disertasi ini. Semoga Allah SWT selalu melimpahkan rahmat dan hidayahNya kepada beliau.

Dr. Drs. Soeprapto Ma’at, MS, Apt sebagai Ko-Promotor II yang telah memberikan waktu, tenaga, pikiran untuk membimbing, memotivasi dan memberikan pengarahan, memperluas keilmuan serta memberikan dukungan moril, sehingga disertasi ini dapat terselesaikan. Beliau adalah fasilitator yang selalu memberikan solusi selama menjalani pendidikan S-3. Saya sangat bangga dapat dibimbing oleh beliau yang benar-benar dapat menjadi panutan sebagai seorang pendidik sejati dengan kedalaman dan keluasan ilmu beliau Semoga Allah SWT selalu melimpahkan rahmat dan hidayahNya kepada beliau.

Rektor Universitas Sumatera Utara, Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTM&H, M.Sc(CTM), Sp.A(K) atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada saya, untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan program Doktor.

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Prof. dr. Gontar A. Siregar, Sp.PD, KGEH atas kesempatan, fasilitas dan bantuan biaya pendidikan dalam mengikuti pendidikan S-3. Demikian pula Pembantu Dekan I Prof. dr. Guslihan Dasa Tjipta, Sp.A(K) atas bantuan dan dukungan dalam menyelesaikan pendidikan S-3.

Prof. dr. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp.A(K) sebagai Ketua Program Studi S-3 Ilmu Kedokteran dan mantan Rektor Universitas Sumatera Utara dan Prof. dr. Harun Rasyid Lubis, Sp.PD-KGH selaku mantan Ketua Program Studi S-3 Ilmu Kedokteran yang telah mengizinkan dan memberikan dukungan dalam membantu memperlancar proses akademik selama mengikuti pendidikan S-3. Demikian juga kepada Sekretaris Program Studi S-3 Prof. Dr. dr. Delfitri Munir, Sp.THT-KL(K) dan Prof. drg. Ismet Daniel Nasution, Ph.D, Sp.Pros(K) selaku mantan Sekretaris Program Studi S-3 Ilmu Kedokteran yang secara berkesinambungan

memberikan dukungan, saran dan motivasi kepada saya selama mengikuti proses pendidikan.

Para penguji disertasi Prof. Dr. dr. Delfitri Munir, Sp.THT-KL(K), Prof. dr. Askaroellah Aboet, Sp.THT-KL(K), Prof. Drs. Sumadio Hadisahputra, Apt., Ph.D, dr. Adang Bachtiar, MPH, DSc, yang telah bersedia memberikan penilaian dan masukan demi sempurnanya disertasi ini.

Para pemberi kuliah S-3 Prof. dr. Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp.A(K); Prof. Dr. Sumono, MS; Drs. Sutarman, M.Sc, Ph.D; Prof. dr. Iskandar Zulkarnaen Lubis, Sp.A(K) (Alm); Prof. Dr. dr. Rozaimah Zain Hamid, MS, Sp.FK; dr. Adang Bachtiar, MPH, DSc; Dr. dr. Rosita Juwita Sembiring, Sp.PK; Dr. Drs. Ridwan Siregar, M.Lib atas pengajaran, bimbingan dan diskusi selama mengikuti pendidikan S-3.

Ketua Departemen Ilmu Kesehatan THT-KL Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Prof. Dr. dr. Abd. Rachman Saragih, Sp.THT-KL(K) serta para staf yang telah memberikan kesempatan, kepercayaan kepada saya serta dengan penuh pengertian dan kesabaran selama saya mengikuti kegiatan pendidikan S-3.

Prof. Dr. dr. Agung Pranoto, M.Kes, Sp.PD-KEMD, FINASIM selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberikan izin kepada saya untuk melakukan penelitian di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

Dr. dr. Karyono Mintaroem, Sp.PA selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya yang telah memberikan izin kepada saya untuk melakukan penelitian di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

dr. Edhi Rianto, MS selaku Kepala Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberikan izin untuk menggunakan fasilitas Laboratorium yang beliau pimpin sehingga penelitian saya dapat selesai. Bapak Heri Sumantoro dan Alfian Dwi Ciptayani, Amd.AK yang telah banyak membantu selama penelitian di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

dr. Hidayat Sujuti, Ph.D, Sp.M selaku Kepala Laboratorium Biokimia Fakultas kedokteran Universitas Brawijaya yang telah memberikan izin untuk menggunakan fasilitas Laboratorium yang beliau pimpin sehingga penelitian saya dapat selesai.

Prof. Dr. dr. Suhartono Taat Putra, MS sebagai staf divisi Patobiologi Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang dengan sabar dan penuh perhatian memberikan motivasi dan memperluas keilmuan saya sehingga disertasi ini dapat selesai. Beliau adalah motivator dan fasilitator terbaik, selalu mengalirkan energi positif, memberi solusi dan mengasah sisi spiritual saya sejak menjalani pendidikan S-3.

Prof. Dr. dr. Harjanto J. M., AIFM staf Departemen Ilmu Faal Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga dan Konsultan Fisiologi Special Sense Organ yang dengan kesabaran dan penuh perhatian memberikan motivasi dan memperluas keilmuan saya sehingga disertasi ini dapat selesai. Wibi Riawan, S.Si dari Departemen Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya yang telah dengan sabar memberikan bantuan dan bimbingan dari awal penelitian, memberikan asupan dan saran, motivasi dan dukungan yang dapat memperluas keilmuan saya sehingga disertasi ini dapat selesai. Disampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih yang tak terhingga.

Drs. Tri Anggono Prijo selaku staf Departemen Biofisika Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga yang telah membantu dalam menstandarisasi alat yang diperlukan untuk perlakuan penelitian.

Bapak Sabari yang telah banyak membantu selama penelitian di Laboratorium Patologi Anatomi RSUD Dr. Soetomo.

M. Syahril Lubis, MP dan dr. Putri C. Eyanoer, MS.Epi. Ph.D yang telah membimbing dan memberikan bantuan di bidang statistik penelitian.

Teman peserta didik Program Doktor Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara angkatan Januari 2010, saya sampaikan terima kasih tak terhingga atas segala kerjasama, kekompakan, serta saling mendukung dalam suka dan duka selama bersama-sama menjalani pendidikan.

Sembah sujud, terima kasih dan hormat tidak terhingga serta cinta yang tak terukur saya kepada kedua orang tua Ayahanda Ir. Tengku Haris Aminullah dan Ibunda Prof. Dr. Ir. Tengku Chairun Nisa, M.Sc dengan penuh kasih sayang membesarkan dan memberikan pendidikan serta senantiasa memanjatkan doa yang tulus bagi keberhasilan anak-anaknya. Kepada kedua mertua dr. Asroel Aboet, Sp.THT-KL(K) dan Baidar Moenaf (Almh) atas perhatian, dukungan, semangat dan doa selama ini. Suami tercinta dr. Edwin Martin Asroel, Sp.OG dan anak terkasih Ramiza Alya Putri Edwina sebagai penyejuk jiwa yang telah merelakan waktu dan menjadikan semangat dorongan untuk menyelesaikan pendidikan ini. Saudara-saudara ku Tengku Mohammad Chairal Abdullah, SE, MBA, Ph.D dan keluarga, dr. Tengku Siti Harilza Zubaidah, Sp.M dan keluarga, dr. Tengku Mohammad Rizki, Sp.OG dan keluarga, serta seluruh keluarga besar yang telah memberikan dorongan, doa dan cinta kasih serta persaudaraan yang erat selama ini. Semoga kita dapat terus membina kerukunan keluarga dan rasa saling mengasihi hingga masa mendatang.

Adinda dr. Agustinus H. W. Purba, dr. M. Budi Caecarian Lubis, dr. Muhammad Reza, dr. Ardyansyah Nasution atas bantuan, motivasi dan dukungan selama ini sehingga disertasi ini dapat selesai. Serta seluruh PPDS Ilmu Kesehatan THT-KL Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara atas pengertian yang diberikan selama saya menjalani pendidikan.

Semua pihak yang telah banyak membantu, baik langsung maupun tidak langsung, handai taulan dan para sejawat yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu, hanya Allah SWT yang mampu memberikan balasan terbaik.

Mudah-mudahan disertasi ini dapat memberi sumbangan yang berharga bagi perkembangan dunia ilmu dan bermanfaat bagi orang banyak. Semoga Allah SWT senantiasa memberi rahmat dan hidayahNya kepada kita semua. Amin. Wabillahi taufiq walhidayah, wassalamualaikum warrahmatullahi wabarakatuh.

Medan, April 2013

The Effect of Curcuminoid to Noise Exposure Viewed from the Expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and Type IV Collagen in Cochlear Fibroblasts of Rattus Norvegicus

(Ex Vivo Laboratory Experimental Study) ABSTRACT

Background: Numerous epidemiological and experimental studies have been carried out, from which empirical evidences were obtained and various theories were suggested to elucidate a series of noise-induced hearing loss (NIHL) process at the molecular level. A recent study found the role of supporting tissues within the cochlear lateral wall which may lead to NIHL in spite there is no damage of sensory cells, outer hair cells and stereocilia. Curcumin is able to regulate several transcription factors, cytokines, protein kinases, adhesion molecules, redox status and enzymes associated with the inflammatory process that plays a major role in chronic diseases, including neurodegenerative, cardiovascular, respiratory, metabolic, autoimmune and neoplastic diseases.

Objective: To demonstrate curcuminoid as the safe and effective phytopharmacy in order to prevent the damage of supporting tissues within the cochlear lateral wall which may lead to NIHL viewed from the expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and Type IV Collagen.

Methods: An ex vivo laboratory experimental study with randomized post test only control group design using Wistar strain white rats Rattus norvergicus. The samples were 40 rats divided into 8 groups: The control group/K1, Group 2/K2 noise (+) for 2 weeks, Group 3a/K3a noise (+) 50 mg curcuminoid (+) for 2 weeks, Group 3b/K3b noise (+) 100 mg curcuminoid (+) for 2 weeks, Group 4a/K4a noise (+) 50 mg curcuminoid (+) for 2 weeks, untreated for the next 2 weeks, Group 4b/K4b noise (+) 100 mg curcuminoid (+) for 2 weeks, untreated for the next 2 weeks, Group 5a/K5a 50 mg curcuminoid (+) for 2 weeks, noise (+) and 50 mg curcuminoid (+) for the next 2 weeks and Group 5b/K5b 100 mg curcuminoid (+) for 2 weeks, noise (+) and 100 mg curcuminoid (+) for the next 2 weeks. This study used curcuminoid derived from Curcuma longa L. (Turmeric) with curcuminoid content levels [28.1 ± 1.0]% w/w compared to Standard. All samples were examined for the expressions of HSP-70,

NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and collagen type IV in cochlear fibroblasts by Immunohistochemistry method. The data were processed with Analysis of Variance (ANOVA) using the Statistical Analysis System (SAS).

Results: The results obtained showed significant decrease in HSP-70 expression (p<0.05) for all treatment groups except for groups 3a with 3b, significant decrease in NFκB expression (p<0.05) for all treatment groups, significant decrease in TLR-2 expression (p<0.05) for all treatment groups except for groups 2 with 3, significant decrease in TLR-4 expression (p<0.05) for all treatment groups except for groups 4a with 4b, significant decrease in MMP-9 expression (p<0.05) for all treatment groups and significant increase in Type IV Collagen expression (p<0.05) for all treatment groups.

Conclusion: Curcuminoid proved to be potentially effective in the prevention and treatment for the damage of supporting tissues within the cochlear lateral wall regarding the decreased expressions of HSP-70,

NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and increased expression of Type IV

Collagen; a dose of curcuminoid 100 mg per day was able to decrease the expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 and MMP-9 and increase the expression of Type IV Collagen more preferably than a dose of curcuminoid 50 mg per day in the noise-exposed cochlear fibroblasts 100 dB 2 hours per day for 2 weeks .

Pengaruh Curcuminoid terhadap Pajanan Bising yang Ditinjau dari Ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan Kolagen Tipe IV

pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus (Studi Eksperimental Laboratorik Ex Vivo)

ABSTRAK

Latar belakang: Telah banyak studi epidemiologis maupun eksperimental dilakukan, dari bukti empiris didapatkan dan berbagai teori telah diajukan untuk menjelaskan rangkaian proses gangguan pendengaran akibat bising (GPAB) sampai tingkat molekuler. Pada penelitian terakhir ditemukan bahwa adanya peran jaringan penyangga pada dinding lateral koklea yang mengakibatkan GPAB walaupun tanpa disertai kerusakan sel sensoris, sel rambut luar dan stereosilia. Curcumin dapat meregulasi beberapa faktor transkripsi, sitokin, protein kinase, molekul adhesi, status redoks dan enzim yang berkaitan dengan proses inflamasi yang berperan mayor dalam penyakit kronik, termasuk neurodegeneratif, kardiovaskular, respirasi, metabolik, autoimun dan penyakit-penyakit neoplastik.

Tujuan penelitian: Membuktikan curcuminoid sebagai fitofarmaka yang efektif dan aman untuk mencegah kerusakan jaringan penyangga pada dinding lateral koklea yang dapat mengakibatkan GPAB ditinjau dari ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan Kolagen Tipe IV.

Metode penelitian: Penelitian eksperimental laboratorik ex vivo menggunakan rancangan randomized post test only control group design dengan menggunakan hewan coba tikus putih Rattus norvergicus galur Wistar. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah 40 ekor tikus yang dibagi menjadi 8 kelompok: Kelompok kontrol/K1, kelompok 2/K2 bising (+) 2 minggu, kelompok 3a/K3a bising (+) curcuminoid 50 mg (+) 2 minggu, kelompok 3b/K3b bising (+) curcuminoid 100 mg (+) 2 minggu, kelompok 4a/K4a bising (+) curcuminoid 50 mg (+) 2 minggu, 2 minggu berikutnya tidak diberi perlakuan, kelompok 4b/K4b bising (+) curcuminoid 100 mg (+) 2 minggu, 2 minggu berikutnya tidak diberi perlakuan, kelompok 5a/K5a curcuminoid 50 mg (+) 2 minggu, 2 minggu berikutnya bising (+) curcuminoid 50 mg (+), dan kelompok 5b/K5b curcuminoid 100 mg (+) 2 minggu, 2 minggu berikutnya bising (+) curcuminoid 100 mg (+). Penelitian ini menggunakan curcuminoid yang berasal dari Curcuma longa L. (Turmeric) dengan kadar curcuminoid [28.1 ± 1.0] % b/b dibanding Standar. Semua sampel dilakukan pemeriksaan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan Kolagen Tipe IV pada fibroblas koklea dengan metode Imunohistokimia. Data hasil penelitian diolah dengan Analysis of Variance (ANOVA) dengan menggunakan Statistical Analysis System (SAS).

Hasil: Hasil pemeriksaan diperoleh terdapat penurunan ekspresi HSP-70 yang bermakna (p<0.05) untuk semua kelompok perlakuan kecuali

kelompok 3a dengan 3b, penurunan ekspresi NFκB yang bermakna

yang bermakna (p<0.05) untuk semua kelompok perlakuan kecuali kelompok 2 dengan 3, penurunan ekspresi TLR-4 yang bermakna (p<0.05) untuk semua kelompok perlakuan kecuali kelompok 4a dengan 4b, penurunan ekspresi MMP-9 yang bermakna (p<0.05) untuk semua kelompok perlakuan dan peningkatan ekspresi Kolagen Tipe IV yang bermakna (p<0.05) untuk semua kelompok perlakuan.

Kesimpulan: Curcuminoid terbukti efektif untuk mencegah dan berpotensi mengobati kerusakan jaringan penyangga pada dinding lateral koklea ditinjau dari penurunan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan peningkatan ekspresi Kolagen Tipe IV dimana curcuminoid dosis 100 mg perhari mampu menurunkan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 dan MMP-9 serta meningkatkan ekspresi Kolagen Tipe IV yang lebih baik dibandingkan curcuminoid dosis 50 mg perhari pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising 100 dB 2 jam perhari selama 2 minggu.

RINGKASAN

Gangguan Pendengaran Akibat Bising (GPAB) merupakan masalah global yang sangat perlu mendapatkan perhatian besar. Metode pencegahan yang tepat perlu dipikirkan dengan harapan target dari upaya penurunan prevalensi GPAB dapat segera terpenuhi. Seperti yang kita ketahui pada penelitian terakhir ditemukan bahwa adanya peranan jaringan penyangga pada dinding lateral koklea yang mengakibatkan gangguan pendengaran akibat pajanan bising walaupun tanpa disertai kerusakan sel sensoris, sel rambut luar dan stereosilia. Dinding lateral koklea tersusun dari jaringan matriks ekstraseluler sebagai struktur penyangga, dimana terdapat fibroblas yang menghasilkan kolagen. Fibroblas peka terhadap stimulus bising yang berlebihan secara kontinyu dan jangka panjang. Perubahan yang terjadi pada fibroblas berpengaruh pada kolagen dan dapat mengganggu fungsi pendengaran. Curcuminoid adalah zat pigmen kuning yang diekstrak dari rimpang yang umumnya berasal dari spesies Curcuma longa L. (kunyit) dan Curcuma xanthorrhiza Roxb (temulawak). Kunyit mengandung bahan aktif curcuminoid yaitu curcumin, bisdemethoxycurcumin dan demethoxycurcumin. Disertasi saya yang berjudul ‘Pengaruh Curcuminoid terhadap Pajanan Bising yang Ditinjau dari Ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan Kolagen Tipe IV pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus’ dilakukan untuk menjawab pertanyaan apakah curcuminoid mampu mencegah dan berpotensi dalam perbaikan fibroblas koklea yang diberi pajanan bising. Penelitian ini dilakukan pada hewan coba tikus putih galur Wistar (Rattus norvegicus) dengan alasan gen dan sekuens struktur dan patobiologi telinga dalam yang homolog (>70%) dengan manusia dan perubahan histopatologis yang diamati dari hasil penelitian pada tikus mempunyai relevansi klinis dengan manusia, selain juga karena mudah didapat dan cepat berkembang biak.

Pada Bab 1 dan Bab 2, saya menjelaskan bahwa masih tingginya angka kejadian gangguan pendengaran yang disebabkan oleh bising, baik di negara maju maupun negara berkembang. Penelitian sebelumnya mendapatkan peningkatan ekspresi HSP-70, TNF-α, IL-6, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan penurunan ekspresi Kolagen Tipe II dan IV fibroblas koklea Rattus norvegicus akibat pajanan bising. Literatur yang ada menjelaskan bahwa curcumin dapat meregulasi beberapa faktor transkripsi, sitokin, protein kinase, molekul adhesi, status redoks dan enzim yang berkaitan dengan proses inflamasi yang berperan mayor dalam penyakit kronik, termasuk neurodegeneratif, kardiovaskular, respirasi, metabolik, autoimun dan penyakit-penyakit neoplastik. Curcumin berperan dalam prevensi dan terapi untuk berbagai penyakit kronik pro inflamasi. Saya berpendapat bahwa curcuminoid mampu menghambat Ca2+ masuk ke dalam sel, menghambat pembentukan Reactive Oxygen Species (ROS), menghambat aktivasi protein kinase sehingga fosforilasi protein dapat ditekan serta mampu menghambat aktivasi dari NFκB yang merupakan protein yang terlibat dalam proses transkripsi gen dari

beberapa sitokin pro inflamasi (TNF-α, IL-6, IL-1) dan MMP-9 pada fibroblas koklea.

Pada Bab 3, saya membagi kelompok penelitian menjadi delapan kelompok perlakuan untuk melihat apakah curcuminoid mampu mencegah dan berpotensi dalam perbaikan fibroblas koklea yang diberi pajanan bising ditinjau dari penurunan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 dan MMP-9 serta peningkatan ekspresi Kolagen Tipe IV.

Pada Bab 4 dan Bab 5, saya membuktikan bahwa curcuminoid mampu mengobati dan mencegah kerusakan fibroblas koklea ditinjau dari penurunan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 dan MMP-9 serta peningkatan ekspresi Kolagen Tipe IV pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising. Saya meyakini sudah terjadinya perubahan klinis berupa gangguan pendengaran tipe sensorineural pada hewan coba akibat pemberian pajanan bising 100 dB selama 2 jam. Sayangnya, gangguan pendengaran ini hanya dapat dinilai dengan pemeriksaan OAE (Otoacoustic Emissions) dan BERA (Brainstem Evoked Response Audiometry). Oleh karena tidak tersedianya alat untuk menilai gangguan pendengaran tersebut pada hewan coba maka perbaikan gangguan pendengaran tipe sensorineural karena pemberian curcuminoid pada hewan coba masih belum dapat dibuktikan walaupun pada tingkat protein menunjukkan ada perbaikan.

Pada penelitian lanjutan dari disertasi ini diharapkan curcuminoid mampu mencegah dan berpotensi dalam perbaikan fibroblas koklea pada manusia yang diberi pajanan bising, sehingga curcuminoid dapat dimanfaatkan oleh masyarakat luas sebagai fitofarmaka untuk mencegah dan mengobati GPAB.

SUMMARY

Noise-induced hearing loss (NIHL) still remains a global issue that needs to be highly paid attention to. Appropriate preventive methods should be considered with the expectation to immediately decrease the prevalence of NIHL. As we noted in the recent study about the role of supporting tissues within the cochlear lateral wall which may lead to NIHL in spite there is no damage of sensory cells, outer hair cells and stereocilia. Cochlear lateral wall is composed of extracellular matrix tissue that provides structural support and fibroblasts found within in order to produce collagen. Fibroblasts are sensitive to long-term, continuous excessive noise exposure. Changes in fibroblasts may influence collagen which furthermore can disrupt the hearing function. Curcuminoid is the major yellow pigment extracted from the rhizome of Curcuma longa L. and Curcuma xanthorrhiza Roxb species. Turmeric contains active substances of curcuminoid, namely curcumin, bisdemethoxycurcumin and demethoxycurcumin. My dissertation, entitled ‘The Effect of Curcuminoid to Noise Exposure Viewed from the Expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and Type IV Collagen in Cochlear Fibroblasts of Rattus Norvegicus’ was carried out in order to answer the question whether curcuminoid is able to prevent and potentially repair the noise-exposed cochlear fibroblasts. The research was conducted on experimental animals, Wistar rats (Rattus norvegicus) based on the homologous gene and structural sequence and inner ear pathobiology (>70%) with humans, histopathologic changes observed from the previous study showed that mice were clinically relevant to humans, as well as because the rats are easily obtainable and can be rapidly multiplied.

In Chapter 1 and Chapter 2, I elucidate the high incidence of NIHL, both in developed and developing countries. Previous study showed the increased expressions of HSP-70, TNF-α, IL-6, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and decreased expressions of Type II and IV Collagen in the noise-exposed cochlear fibroblasts of Rattus norvegicus. The recent literatures point out that curcumin is able to regulate several transcription factors, cytokines, protein kinases, adhesion molecules, redox status and enzymes associated with the inflammatory process that plays a major role in chronic diseases, including neurodegenerative, cardiovascular, respiratory, metabolic, autoimmune and neoplastic diseases as well as in the prevention and treatment of various chronic proinflammatory diseases. I assume that curcuminoid is able to inhibit Ca2+

In Chapter 3, I distribute the study groups into eight treatment groups in order to find out whether curcuminoid is able to prevent and potentially repair the noise-exposed cochlear fibroblasts viewed from the decreased entry into cells, inhibit the formation of Reactive Oxygen Species (ROS), inhibit activation of the protein kinase thus protein phosphorylation can be suppressed and inhibit the activation of NFκB, a protein involved in the process of gene transcription of several proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1) and MMP-9 in cochlear fibroblasts.

expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and increased expression of Type IV collagen.

In Chapter 4 and Chapter 5, I prove that curcuminoid is able to treat and prevent the damage of the noise-exposed cochlear fibroblasts viewed from the decreased expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 and MMP-9 and increased expression of Type IV collagen. I believe that clinical change in the form of sensorineural hearing loss has already occurred in experimental animals with the 100 db noise exposure for 2 hours. Unfortunately, this hearing impairment can only be assessed by OAE (Otoacoustic Emissions) and BERA (Brainstem Evoked Response Audiometry) examination. Due to the device unavailability to assess the hearing loss in experimental animals, the improvement in sensorineural hearing loss in animals treated by curcuminoid still remains unproofed although the improvement has already been shown at the protein level. In the further research of this dissertation, curcuminoid is hopefully able to prevent and potentially repair the noise-exposed cochlear fibroblasts in humans, thus curcuminoid can be effectively and largely used by communities as a phytopharmacy in order to prevent and treat NIHL.

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ... i

ABSTRACT ... iii

RINGKASAN ... ... v

SUMMARY ... vii

UCAPAN TERIMA KASIH ...ix

DAFTAR RIWAYAT HIDUP ... xv

DAFTAR ISI ………..…... xvi

DAFTAR SINGKATAN ……….………..……... xix

DAFTAR GAMBAR ... xxiv

DAFTAR TABEL ... xxvi

DAFTAR LAMPIRAN ... xxvii

BAB I PENDAHULUAN …... 1

1.1 Latar Belakang Masalah ……... 1

1.2 Rumusan Masalah …... 10

1.3 Tujuan Penelitian ……... 11

1.3.1 Tujuan umum ... 11

1.3.2 Tujuan khusus ... 11

1.4 Manfaat Penelitian …... 13

1.5 Orisinalitas …... 14

1.6 Potensi Hak Atas Kekayaan Intelektual (HAKI) ... 14

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 16

2.1 Definisi ... 16

2.2 Epidemiologi ... 19

2.2.1 Prevalensi ……... 21

2.3 Kebijkan dan Peraturan Perundang-undangan ………... 23

2.4 Sistem Pendengaran …... 25

2.4.1 Anatomi koklea ... 25

2.4.2 Transmisi suara ... 36

2.4.3 Mekanoelektrik transduksi koklea ... 38

2.5 Pengaruh Bising Terhadap Organ Pendengaran ... 44

2.6 Bunyi …... 46

2.6.1 Definisi bunyi …... 46

2.6.2 Produksi dan perambatan bunyi …... 47

2.6.3 Frekuensi bunyi ... 48

2.6.4 Tekanan bunyi ... 49

2.6.5 Intensitas bunyi ... 50

2.7 Kebisingan ... 51

2.7.1 Definisi kebisingan ... 51

2.7.2 Pengukuran tingkat kebisingan ... 52

2.7.3 Nilai ambang batas kebisingan ... 52

2.8 Respon Stres Intraseluler ... 60

2.8.1 Heat shock response dan mekanisme pengaturannya melalui aktivasi Hsf-1 ... 68

2.8.2 Heat shock protein dan molekul chaperon ... 70

2.8.3 Respon stres sel koklea dan organ Corti terhadap kebisingan ... 74

2.9 Nuclear Factor Kappa B (NFκB) ... 77

2.9.1 Peran NFκB akibat pengaruh bising pada koklea ...… 80

2.10 Toll-like Receptor (TLR) ... 84

2.10.1 Peran TLR akibat pengaruh bising pada koklea …….. 92

2.10.2 Efek curcumin terhadap TLR ... 94

2.11 Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) ... 96

2.12 Kolagen ... 103

2.13 Kunyit ... 107

2.13.1 Morfologi tumbuhan ... 108

2.13.2 Sifat kimia, fisika, zat aktif dan khasiat kunyit ……….. 109

2.13.3 Kandungan kunyit ... 110

2.13.4 Manfaat kunyit ... 111

2.13.5 Dosis terapi curcumin ... 118

2.14 Perubahan Epigenetik dalam Sintesis Protein ... 122

2.15 Perbandingan Struktur dan Fungsi Pendengaran Spesies Berbeda ... 127

2.16 Teknik Imunohistokimia untuk Identifikasi Ekspresi Protein ... 130

2.17 Kerangka Teori ... 132

2.18 Kerangka Konspetual dan Hipotesis Penelitian…..……..……… 133

2.18.1 Kerangka konseptual ... 133

2.18.2 Hipotesis ... 136

BAB III METODE PENELITIAN ... 138

3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian ... 138

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ... 140

3.2.1 Tempat penelitian ... 140

3.2.2 Waktu penelitian ... 140

3.3 Variabel Penelitian ... 141

3.3.1 Variabel bebas ... 141

3.3.2 Variabel terikat ... 141

3.3.3 Variabel terkendali ... 141

3.4 Sampel ... 141

3.4.1 Besar sampel ... 143

3.4.2 Pengelompokan sampel ... 143

3.4.3 Teknik pengambilan sampel ... 145

3.5 Definisi Operasional Penelitian ... 146

3.6 Alat dan Bahan Penelitian ... 149

3.6.1 Hewan coba yang dikenai perlakuan ... 149

3.6.2 Bahan perlakuan ... 150

3.7 Prosedur Penelitian ... 152

3.7.1 Tahap persiapan ... 152

3.7.2 Prosedur pengukuran intensitas kebisingan ... 152

3.7.3 Prosedur pemberian curcuminoid... 153

3.7.4 Perlakuan pada tikus ... 153

3.7.5 Prosedur pengambilan jaringan koklea tikus ……... 154

3.7.6 Pemeriksaan laboratorium ... 154

3.7.7 Penghitungan sel ... 156

3.8 Alur Penelitian ... 158

3.9 Analisis Statistik ... 159

BAB IV HASIL PENELITIAN ... 160

4.1 Hasil Standarisasi Serbuk Curcuminoid ... 160

4.2 Profil Ekspresi Protein Fibroblas ... 162

4.3 Gambar Fibroblas Dinding Lateral Koklea dengan Pengecatan HE ... 167

4.4 Hasil Uji Curcuminoid dalam Mencegah Kerusakan Sel Fibroblas Koklea Akibat Efek Pajanan Bising ... 167

4.4.1 Ekspresi HSP-70 ... 168

4.4.2 Ekspresi NFκB ... 171

4.4.3 Ekspresi TLR-2 dan TLR-4 ... 174

4.4.4 Ekspresi MMP-9 ... 179

4.4.5 Ekspresi Kolagen Tipe IV ... 182

BAB V PEMBAHASAN ... 186

5.1 Curcuminoid ... 188

5.2 Manfaat Curcuminoid ... 189

5.3 Efek Curcuminoid Terhadap Ekspresi HSP-70 pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus ... 195

5.4 Efek Curcuminoid Terhadap Ekspresi NFκB pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus ... 198

5.5 Efek Curcuminoid Terhadap Ekspresi TLR-2 dan TLR-4 pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus …... 205

5.6 Efek Curcuminoid terhadap Ekspresi MMP-9 Pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus ... 210

5.7 Efek Curcuminoid terhadap Ekspresi Kolagen Tipe IV Pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus ... 216

5.8 Keterbatasan Penelitian ... 222

5.9 Penemuan Baru ... 223

5.10 Implikasi Hasil ... 223

5.10.1 Pemanfaatan hasil penelitian ... 223

5.10.2 Pengembangan penelitian ... 224

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN ... 225

6.1 Kesimpulan ... 225

6.2 Saran ... 226

DAFTAR PUSTAKA ... 227

DAFTAR GAMBAR

No Judul Halaman

Gambar 2.1a Koklea ... 26

Gambar 2.1b Koklea dengan Potongan Melintang ... 26

Gambar 2.2 Anatomi Koklea ... 27

Gambar 2.3 Potongan Melintang Organ Koklea ... 28

Gambar 2.4 Skala Vestibuli dan Skala Timpani di Koklea ... 29

Gambar 2.5 Lebar Membran Basilaris dari Basal ke Apeks ... 31

Gambar 2.6 Model Membran Basilaris dengan Organ Corti ... 32

Gambar 2.7 Sel Rambut Dalam dan Sel Rambut Luar ... 33

Gambar 2.8 Sel Rambut Luar dan Dalam Dilihat dengan Mikroskop Elektron ... 34

Gambar 2.9a Tip Link ... 35

Gambar 2.9b Tip Link Dilihat dengan Mikroskop Elektron ... 35

Gambar 2.10 Organ Corti ... 36

Gambar 2.11 Transmisi Suara ke Koklea ... 37

Gambar 2.12 Arah Gerakan Cairan Perilimfe yang Diakibatkan oleh Gerakan Stapes di Foramen Ovale ... 38

Gambar 2.13 Pemetaan Suara Berdasarkan Frekuensi di Membran Basilaris ... 39

Gambar 2.14 Arah Gerakan Stereosilia pada Fase Depolarisasi dan Hiperpolarisasi ... 40

Gambar 2.15 Prestin (Protein Membran) Memendek Saat Depolarisasi dan Memanjang Saat Hiperpolarisasi ... 42

Gambar 2.16 Proses Transduksi di Sel Rambut Dalam dan Sel Rambut Luar ... 43

Gambar 2.17 Spektrum Frekuensi dari Beberapa Contoh Rangsangan Auditori: Nada Murni, Nada Musik, Bising ... 49

Gambar 2.18 Beberapa Contoh Sumber Suara dengan Intensitas Suara (dB) dan Tekanan Suara (Pa) ... 51

Gambar 2.19 Koklea yang Diamati 2 Minggu Setelah Pajanan Kebisingan ... 58

Gambar 2.20 Spektrum Stres ... 63

Gambar 2.21 Jalur Transduksi Sinyal Protein Ras ... 65

Gambar 2.22 Skema Mekanisme Beberapa Regulasi Aktivitas Hsf-1 dan Heat Shock Response ... 67

Gambar 2.23 Struktur Umum Protein Secara Molekuler ... 71

Gambar 2.24 Jalur Patologis Potensial Berhubungan dengan Kerusakan Koklea Akibat Paparan Bising ... 81

Gambar 2.25 Jalur Sinyal Toll-Like Receptor ... 89

Gambar 2.26 Komponen Rantai Unik dari TLR-2 dan TLR-4 ... 91

Gambar 2.27 Struktur MMP-9 ... 97

Gambar 2.28 Struktur MMP ... 98

Gambar 2.29 Kolagen: Rantai-α, Tripel Heliks, Fibril dan Serat ... 106

Gambar 2.30 Struktur Kimia Curcumin ... 114

Gambar 2.32 Skema Pengemasan DNA dalam Histon ... 122

Gambar 2.33 Mekanisme Translokasi Nuclear NFκB ... 124

Gambar 2.34a Modifikasi Histon ... 125

Gambar 2.34b Asetilasi Histon ... 125

Gambar 2.35 Model Represi, Kompleks Hsf-1/MTA-1/NuRD ... 126

Gambar 2.36 Perbandingan Audiogram Manusia dan Tikus ... 127

Gambar 2.37 Rentang Ambang Pendengaran pada Hewan Coba Laboratorium ... 128

Gambar 2.38 Perbandingan Noise-Induced Threshold Shifts pada Beberapa Studi ... 130

Gambar 2.39 Pelabelan Streptavidin-Peroksidase ... 131

Gambar 2.40 Kerangka Teori ... 132

Gambar 2.41 Kerangka Konseptual ... 133

Gambar 4.1 Diagram Hasil Pemeriksaan KLT ... 161

Gambar 4.2a Ekspresi Protein Tiap Kelompok Perlakuan dalam Grafik Linear ... 163

Gambar 4.2b Ekspresi Protein tiap Kelompok Perlakuan dalam Grafik Batang ... 164

Gambar 4.3 Penampang Dinding Lateral Koklea Tikus dengan Pengecatan HE ... 167

Gambar 4.4 Ekspresi HSP-70 tiap Kelompok Perlakuan dalam Grafik Batang ... 168

Gambar 4.5 Ekspresi HSP-70 pada Setiap Kelompok Perlakuan ... 170

Gambar 4.6 Ekspresi NFκB tiap Kelompok Perlakuan dalam Grafik Batang ... 171

Gambar 4.7 Ekspresi NFκB pada Setiap Kelompok Perlakuan ... 173

Gambar 4.8 Ekspresi TLR-2 dan TLR-4 tiap Kelompok Perlakuan dalam Grafik Batang ... 174

Gambar 4.9 Ekspresi TLR-2 pada Setiap Kelompok Perlakuan ... 176

Gambar 4.10 Ekspresi TLR-4 pada Setiap Kelompok Perlakuan ... 178

Gambar 4.11 Ekspresi MMP-9 tiap Kelompok Perlakuan dalam Grafik Batang ... 179

Gambar 4.12 Ekspresi MMP-9 pada Setiap Kelompok Perlakuan ... 181

Gambar 4.13 Ekspresi Kolagen Tipe IV tiap Kelompok Perlakuan dalam Grafik Batang ... 182

Gambar 4.14 Ekspresi Kolagen Tipe IV pada Setiap Kelompok Perlakuan ...184

DAFTAR TABEL

No Judul Halaman

Tabel 2.1 Pengukuran Kehilangan Pendengaran yang Digunakan di

Amerika Serikat ... 18 Tabel 2.2 Komposisi Cairan Koklea ... 30 Tabel 2.3 Lama Kerja yang Diperkenankan Berdasarkan Intensitas

Bising (dB(A)) Menurut ACGIH, OSHA, ISO dan

Menaker RI ... 53 Tabel 2.4 Distribusi TLR pada Berbagai Tipe Sel ... 88 Tabel 2.5 Pembagian TLR ... 90 Tabel 2.6 Grup MMP99

Tabel 2.7 Komposisi Kimia Kunyit ... 111 Tabel 2.8 Efek Farmakologis Zat Aktif yang Terkandung dalam

Rimpang Kunyit ... 113 Tabel 4.1 Kadar Curcuminoid dalam Sampel Dibanding Curcuminoid

dalam Standar ... 160 Tabel 4.2 Nilai Rerata dan SD pada Setiap Variabel dalam

Setiap Kelompok ... 162 Tabel 4.3 Hasil Uji ANOVA Terhadap Ekspresi HSP-70 ... 169 Tabel 4.4 Hasil Uji ANOVA Terhadap Ekspresi NFκB... 172 Tabel 4.5 Hasil Uji ANOVA Terhadap Ekspresi TLR-2 ... 175 Tabel 4.6 Hasil Uji ANOVA Terhadap Ekspresi TLR-4 ... 177 Tabel 4.7 Hasil Uji ANOVA Terhadap Ekspresi MMP-9 ... 180 Tabel 4.8 Hasil Uji ANOVA Terhadap Ekspresi Kolagen Tipe IV ... 183

DAFTAR SINGKATAN

5-LOX = 5-Lipoxygenase 6-OHDA = 6-Hydroxydopamine

ACGIH = American Conference of Governmental Industrial Hygienists AChE = Acetylcolinesterase

Akt = Protein Kinase B Ala = Alanine

AMA = American Medical Association AP-1 = Activated Protein-1

ATM = Ataxia Telangiectasia Mutated BAFFR = B-Cell Activating Factor Receptor

Ba/F3 = Murine Interleukin-3 Dependent Pro-B Cell Line BALB/c = Albino, Laboratory-bred Strain of The House Mouse Bcl-2 = B-Cell Lymphoma-2

BCR = B-Cell Receptor

BERA = Brainstem Evoked Response Audiometry BLS = Bureau of Labour Statistics

BM = Berat Molekul

BSA = Bismuth Sulfite Agar

C3H/HeN = Agouti Strain of Inbred Mouse Ca2+ = Calcium

cAMP = Cyclic Adenosine Monophosphate CA-MMP = Cysteine Array Matrix Metalloproteinase CBF = Cochlear Blood Flow

cc = Cubic Centimeter CD = Compact Disc

CD = Cluster of Differentiation

cGMP = Cyclic Guanosine Monophosphate Cl- = Chloride

cm = Centimeter

CMC = Carboxy Methyl Cellulose

CMMP = Chicken Matrix Metalloproteinase COX-2 = Cyclooxygenase-2

CP = Cyclophospamide CSF = Cerebro Spinal Fluid

CXCR-4 = Chemokine Receptor Type-4 Cy-MMP = Cynops Matrix Metalloproteinase DAB = 3,3’-Diaminobenzidine

dB = Desibel

dB(A) = DeciBel A-weighted DG = Dystroglycan

dH2O = Distilled Water

dH2O2 = Distilled Hydrogen Peroxide

Dirjen BPOM = Direktorat Jenderal Badan Pengawasan Obat dan Makanan DM = Diabetes Melitus

DNA = Deoxyribonucleic Acid

EAE = Experimental Allergic Encephalomyelitis ECM = Extracellular Matrix

ED50 = Effective Dose

EDTA = Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid EGFR = Epidermal Growth Factor Receptor EGR-1 = Early Growth Response Protein-1 eHSP-70 = Extracellular Heat Shock Protein-70 ER = Endoplasmic Reticulum

ERK = Extracellular Signal Regulated Kinase Exact Sig. = Exact Significance

FAO = Food and Agriculture Organization FBS = Fetal Bovine Serum

GaIN = Galactosamine Gly = Glycine

Gly-X-Y = Glycine-X-Y

GPAB = Gangguan Pendengaran Akibat Bising GPx = Glutathione Peroxidase

g = Gram

GSH = Gluthathione Sulfhydryl GST = Gluthathione S-Transferase H2O2 = Hydrogen Peroxide

H2SO4 = Sulfuric Acid

HCl = Hydrochloride HCO3 = Asam Karbonat HDAC = Histone Deacetylase HE = Hematoxylin Eosin HEI-193 = House Ear Institute-193

HER = Human Epidermal Growth Factor Receptor HIV = Human Immunodeficiency Virus

HL = Hearing Level

HL-60 = Human Leukemia-60 HRP = Horse Radish Peroxidase HSC = Hepatic Stellate Cells HSE = Heat Shock Element Hsf-1 = Heat Shock Factor-1 HSP = Heat Shock Protein

Hz = Hertz

IBD = Inflammatory Bowel Disease ICAM-1 = Intracellular Adhesion Molecule-1 IFN = Interferon

IGF = Insulin-like Growth Factor

IκB = Inhibitor Kappa-Beta

IκK = Inhibitor Kappa-Beta Kinase

IκKp = Inhibitor Kappa-Beta Kinase Protein IL = Interleukin

Ile = Isoleucine

IP3 = Inositol-1,4,5-triphosphate

IRAK = IL-1 R-Associated Protein Kinase IRF-3 = Interferon Regulatory Factor-3

ISO = International Organization for Standardization ISO = Isoproterenol

JECFA = Joint FAO/ WHO Expert Committee on Food and Additives JNK = c-Jun NH2 Terminal Kinase

K+ = Kalium

K562 = Human Myelogenous Leukemia Cell Line kCal = Kilocalory

kDa = Kilodalton kg = Kilogram

kgBB = Kilogram Berat Badan kHz = Kilohertz

KLT = Kromatografi Lapis Tipis Leu = Leucine

LOX = Lipoxygenase LPS = Lipopolysaccharide LRR = Leucine-rich repeat

LTβR = Lymphotoxin-β Receptor

m = Meter

MAL = MyD88 Adaptor Like

MAP = Mannitol Adenine Phosphate

MAPK = Mannitol Adenine Phosphate Kinase MCH = Mean Corpuscular Haemoglobin MCL = Mantle Cell Lymphoma

MCP-1 = Monocyte Chemotactic Peptide-1

MDA-MB-231= Human Mammary Epithelial Tumor Cell Line Menaker = Kementrian Tenaga Kerja

MET = Mekano Elektrik Transduksi mg = Miligram

mg/dL = Miligram/desiliter

MIP = Macrophage Inflammatory Protein mM = Milimolar

mm = Milimeter

MMP = Matrix Metalloproteinase

MMP-23a = Matrix Metalloproteinase-23 Antibody mPa = Milipascal

MPO = Myeloperoxidase mRNA = Messenger RNA ms = Millisecond m/s = Meter/second

MT-MMP = Membrane Type-Matrix Metalloproteinase MTA = Metastasis-associated Protein

mV = Milivolt

MyD88 = Myeloid Differentiation Primary Response Gene (88) Na+ = Natrium

NaCl = Sodium Chloride NaN3 = Sodium Azide

NaOH = Sodium Hydroxide

NFκB = Nuclear Factor Kappa-Beta NGT = Naso Gastric Tube

NIOSH = The National Institute for Occupational Safety and Health

nm = Nanometer

NO = Nitric Oxide

NOS = Nitrous Oxide System

NTHI = Non Typeable Haemophylus Influenzae

NuRD = Nucleosome Remodelling and Histone Deacetylase OAE = Otoacoustic Emissions

OHC = Outer Hair Cell

OSHA = Occupational Safety and Health Administration p210bcr/abl = Activated Tyrosine Kinase Oncogene

P450 = Pigment450

p60Hop = Tetratricopeptide Repeat Containing Cofactor p60

Pa = Pascal

PAI-1 = Plasminogen Activator Inhibitor-1

PAMP = Pathogen Associated Molecular Pattern PBS = Phosphate Buffer Saline

PGPKT = Penanggulangan Gangguan Pendengaran dan Ketulian pH = Potential Hydrogen

PI3K = Phosphatidylinositol 3-Kinase

PIP2 = Phosphatidylinositol 4,5-Biphosphate PKC = Protein Kinase C

PLC = Phospholipase C PMN = Polymorphonuclear

PPAR-γ = Peroxisome Proliferator Activated Receptor- γ PPM = Parts per Million

PTS = Permanent Threshold Shift PRR = Pattern Recognition Receptor

RASI-1 = Rheumatoid Arthritis Synovium Inflammed-1 ROS = Reactive Oxygen Species

SA-HRP = Streptavidine Activated-Horse Radish Peroxidase SD = Standar Deviasi

SK-HEP-1 = Hepatocellular Carcinoma Cell Line SLF = Spiral Ligament Fibrocytes

SLM = Sound Level Meter SOD = Superoxide Dismutase SPL = Sound Pressure Level STS = Standard Threshold Shift

SW480 = Human Colon Adenocarcinoma Cell Line T1/2 = Half Time

TAB = TGF-β Activated Kinase-1 Binding Protein Tailed Sig. = Tailed Significance

TAK-1 = TGF-β Activated Kinase-1 TCR = T-Cell Receptor

TGF-β = Transforming Growth Factor-β Th = T Helper

t/ha = Ton/hectare

TIMPs = Tissue Inhibitors of Metalloproteinases TIR = Toll-IL1 Receptor

Tip-DC = TNF-α iNOS-producing Dendritic Cell TLR = Toll-like Receptor

TMB = Tetra Methyl Benzidine TNBS = Trinitrobenzene Sulfonic Acid TNF-α = Tumor Necrosis Factor-α

TNFR = Tumor Necrosis Factor Receptor

TPA = 12-O-Tetradecanoyl-phorbol 13-Acetate

TRAF-6 = Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor-6 TRAM = TRIF-related Adaptor Molecule

TRIF =Toll-like Receptor Domain Containing Adapter Inducing Interferon-β

TrisHCl = Tris Hydrochloride

TTS = Temporary Threshold Shift

UCLA = University of California at Los Angeles uPA = Urokinase Type Plasminogen Activator

uPAR = Urokinase Type Plasminogen Activator Receptor UV = Ultra Violet

VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor WHO = World Health Organization

XMMP = Xenopus Matrix Metalloproteinase µg = Mikrogram

µL = Mikroliter µPa = Mikropascal

DAFTAR LAMPIRAN

No Judul Halaman

Lampiran 1 Sertifikat Kelaikan Etik ... 250 Lampiran 2.1 Surat Izin Melakukan Penelitian Pendahuluan ... 251 Lampiran 2.2 Surat Izin Melakukan Penelitian Pendahuluan ... 252 Lampiran 3.1 Surat Izin Melakukan Penelitian ... 253 Lampiran 3.2 Surat Izin Melakukan Penelitian ... 254 Lampiran 3.3 Surat Izin Melakukan Penelitian ... 255 Lampiran 4.1 Sertifikat Pengujian ... 256 Lampiran 4.2 Perhitungan Kadar Curcumin dalam Sampel vs

Curcumin dalam Standar dan Perhitungan Kadar Curcuminoid dalam Sampel vs Curcuminoid

dalam Standar ... 257 Lampiran 4.3 Hasil Pemeriksaan KLT ... 258 Lampiran 5.1 Laporan Hasil Pengujian/Standarisasi Alat Stresor

Bising ... 261 Lampiran 5.2 Spesifikasi Alat Stresor Bising ... 264 Lampiran 6 Konversi Perhitungan Dosis pada Hewan Coba ... 266 Lampiran 7 Volume Maksimum Larutan Sediaan Uji yang dapat

Diberikan pada Hewan Coba ... 267 Lampiran 8 Kelompok Perlakuan pada Hewan Coba ... 268 Lampiran 9.1 Skema Pembuatan Preparat dengan Metode

Parafin ... 269 Lampiran 9.2 Pewarnaan Imunohistokimia ... 270 Lampiran 9.3 Skema Cara Penghitungan sel ... 271 Lampiran 10.1 Gambar Alat Stresor Bising ... 272 Lampiran 10.2 Gambar Prosedur Penelitian ... 273 Lampiran 10.3 Gambar Prosedur Pemeriksaan Imunohistokimia ... 275 Lampiran 11 Data Sampel Penelitian ... 281 Lampiran 12 Hasil Analisis Statistik ...282

RINGKASAN

Gangguan Pendengaran Akibat Bising (GPAB) merupakan masalah global yang sangat perlu mendapatkan perhatian besar. Metode pencegahan yang tepat perlu dipikirkan dengan harapan target dari upaya penurunan prevalensi GPAB dapat segera terpenuhi. Seperti yang kita ketahui pada penelitian terakhir ditemukan bahwa adanya peranan jaringan penyangga pada dinding lateral koklea yang mengakibatkan gangguan pendengaran akibat pajanan bising walaupun tanpa disertai kerusakan sel sensoris, sel rambut luar dan stereosilia. Dinding lateral koklea tersusun dari jaringan matriks ekstraseluler sebagai struktur penyangga, dimana terdapat fibroblas yang menghasilkan kolagen. Fibroblas peka terhadap stimulus bising yang berlebihan secara kontinyu dan jangka panjang. Perubahan yang terjadi pada fibroblas berpengaruh pada kolagen dan dapat mengganggu fungsi pendengaran. Curcuminoid adalah zat pigmen kuning yang diekstrak dari rimpang yang umumnya berasal dari spesies Curcuma longa L. (kunyit) dan Curcuma xanthorrhiza Roxb (temulawak). Kunyit mengandung bahan aktif curcuminoid yaitu curcumin, bisdemethoxycurcumin dan demethoxycurcumin. Disertasi saya yang berjudul ‘Pengaruh Curcuminoid terhadap Pajanan Bising yang Ditinjau dari Ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan Kolagen Tipe IV pada Fibroblas Koklea Rattus Norvegicus’ dilakukan untuk menjawab pertanyaan apakah curcuminoid mampu mencegah dan berpotensi dalam perbaikan fibroblas koklea yang diberi pajanan bising. Penelitian ini dilakukan pada hewan coba tikus putih galur Wistar (Rattus norvegicus) dengan alasan gen dan sekuens struktur dan patobiologi telinga dalam yang homolog (>70%) dengan manusia dan perubahan histopatologis yang diamati dari hasil penelitian pada tikus mempunyai relevansi klinis dengan manusia, selain juga karena mudah didapat dan cepat berkembang biak.

Pada Bab 1 dan Bab 2, saya menjelaskan bahwa masih tingginya angka kejadian gangguan pendengaran yang disebabkan oleh bising, baik di negara maju maupun negara berkembang. Penelitian sebelumnya mendapatkan peningkatan ekspresi HSP-70, TNF-α, IL-6, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan penurunan ekspresi Kolagen Tipe II dan IV fibroblas koklea Rattus norvegicus akibat pajanan bising. Literatur yang ada menjelaskan bahwa curcumin dapat meregulasi beberapa faktor transkripsi, sitokin, protein kinase, molekul adhesi, status redoks dan enzim yang berkaitan dengan proses inflamasi yang berperan mayor dalam penyakit kronik, termasuk neurodegeneratif, kardiovaskular, respirasi, metabolik, autoimun dan penyakit-penyakit neoplastik. Curcumin berperan dalam prevensi dan terapi untuk berbagai penyakit kronik pro inflamasi. Saya berpendapat bahwa curcuminoid mampu menghambat Ca2+ masuk ke dalam sel, menghambat pembentukan Reactive Oxygen Species (ROS), menghambat aktivasi protein kinase sehingga fosforilasi protein dapat ditekan serta mampu menghambat aktivasi dari NFκB yang merupakan protein yang terlibat dalam proses transkripsi gen dari

beberapa sitokin pro inflamasi (TNF-α, IL-6, IL-1) dan MMP-9 pada fibroblas koklea.

Pada Bab 3, saya membagi kelompok penelitian menjadi delapan kelompok perlakuan untuk melihat apakah curcuminoid mampu mencegah dan berpotensi dalam perbaikan fibroblas koklea yang diberi pajanan bising ditinjau dari penurunan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 dan MMP-9 serta peningkatan ekspresi Kolagen Tipe IV.

Pada Bab 4 dan Bab 5, saya membuktikan bahwa curcuminoid mampu mengobati dan mencegah kerusakan fibroblas koklea ditinjau dari penurunan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 dan MMP-9 serta peningkatan ekspresi Kolagen Tipe IV pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising. Saya meyakini sudah terjadinya perubahan klinis berupa gangguan pendengaran tipe sensorineural pada hewan coba akibat pemberian pajanan bising 100 dB selama 2 jam. Sayangnya, gangguan pendengaran ini hanya dapat dinilai dengan pemeriksaan OAE (Otoacoustic Emissions) dan BERA (Brainstem Evoked Response Audiometry). Oleh karena tidak tersedianya alat untuk menilai gangguan pendengaran tersebut pada hewan coba maka perbaikan gangguan pendengaran tipe sensorineural karena pemberian curcuminoid pada hewan coba masih belum dapat dibuktikan walaupun pada tingkat protein menunjukkan ada perbaikan.

Pada penelitian lanjutan dari disertasi ini diharapkan curcuminoid mampu mencegah dan berpotensi dalam perbaikan fibroblas koklea pada manusia yang diberi pajanan bising, sehingga curcuminoid dapat dimanfaatkan oleh masyarakat luas sebagai fitofarmaka untuk mencegah dan mengobati GPAB.

SUMMARY

Noise-induced hearing loss (NIHL) still remains a global issue that needs to be highly paid attention to. Appropriate preventive methods should be considered with the expectation to immediately decrease the prevalence of NIHL. As we noted in the recent study about the role of supporting tissues within the cochlear lateral wall which may lead to NIHL in spite there is no damage of sensory cells, outer hair cells and stereocilia. Cochlear lateral wall is composed of extracellular matrix tissue that provides structural support and fibroblasts found within in order to produce collagen. Fibroblasts are sensitive to long-term, continuous excessive noise exposure. Changes in fibroblasts may influence collagen which furthermore can disrupt the hearing function. Curcuminoid is the major yellow pigment extracted from the rhizome of Curcuma longa L. and Curcuma xanthorrhiza Roxb species. Turmeric contains active substances of curcuminoid, namely curcumin, bisdemethoxycurcumin and demethoxycurcumin. My dissertation, entitled ‘The Effect of Curcuminoid to Noise Exposure Viewed from the Expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and Type IV Collagen in Cochlear Fibroblasts of Rattus Norvegicus’ was carried out in order to answer the question whether curcuminoid is able to prevent and potentially repair the noise-exposed cochlear fibroblasts. The research was conducted on experimental animals, Wistar rats (Rattus norvegicus) based on the homologous gene and structural sequence and inner ear pathobiology (>70%) with humans, histopathologic changes observed from the previous study showed that mice were clinically relevant to humans, as well as because the rats are easily obtainable and can be rapidly multiplied.

In Chapter 1 and Chapter 2, I elucidate the high incidence of NIHL, both in developed and developing countries. Previous study showed the increased expressions of HSP-70, TNF-α, IL-6, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and decreased expressions of Type II and IV Collagen in the noise-exposed cochlear fibroblasts of Rattus norvegicus. The recent literatures point out that curcumin is able to regulate several transcription factors, cytokines, protein kinases, adhesion molecules, redox status and enzymes associated with the inflammatory process that plays a major role in chronic diseases, including neurodegenerative, cardiovascular, respiratory, metabolic, autoimmune and neoplastic diseases as well as in the prevention and treatment of various chronic proinflammatory diseases. I assume that curcuminoid is able to inhibit Ca2+

In Chapter 3, I distribute the study groups into eight treatment groups in order to find out whether curcuminoid is able to prevent and potentially repair the noise-exposed cochlear fibroblasts viewed from the decreased entry into cells, inhibit the formation of Reactive Oxygen Species (ROS), inhibit activation of the protein kinase thus protein phosphorylation can be suppressed and inhibit the activation of NFκB, a protein involved in the process of gene transcription of several proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1) and MMP-9 in cochlear fibroblasts.

expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 and increased expression of Type IV collagen.

In Chapter 4 and Chapter 5, I prove that curcuminoid is able to treat and prevent the damage of the noise-exposed cochlear fibroblasts viewed from the decreased expressions of HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 and MMP-9 and increased expression of Type IV collagen. I believe that clinical change in the form of sensorineural hearing loss has already occurred in experimental animals with the 100 db noise exposure for 2 hours. Unfortunately, this hearing impairment can only be assessed by OAE (Otoacoustic Emissions) and BERA (Brainstem Evoked Response Audiometry) examination. Due to the device unavailability to assess the hearing loss in experimental animals, the improvement in sensorineural hearing loss in animals treated by curcuminoid still remains unproofed although the improvement has already been shown at the protein level. In the further research of this dissertation, curcuminoid is hopefully able to prevent and potentially repair the noise-exposed cochlear fibroblasts in humans, thus curcuminoid can be effectively and largely used by communities as a phytopharmacy in order to prevent and treat NIHL.

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Di negara-negara industri, kebisingan merupakan masalah utama kesehatan kerja (Suma'mur, 1993). Kebisingan juga merupakan salah satu faktor dari lingkungan kerja yang dapat menyebabkan penyakit akibat kerja yang tercantum dalam Kepres No. 22 Tahun 1993. Kebisingan di tempat kerja dapat mengurangi kenyamanan dan ketenangan kerja, mengganggu indera pendengaran, mengakibatkan penurunan daya dengar dan bahkan pada akhirnya dapat mengakibatkan ketulian yang menetap (Mulia, 2005).

Berdasarkan laporan WHO (2004), diperkirakan hampir 14% dari total tenaga kerja di negara industri terpapar bising melebihi 90 dB di tempat kerjanya. Lebih dari 30 juta orang di Amerika terpapar bising 85 dB atau lebih (NIOSH, 1998). Diperkirakan 5-10 juta orang di Amerika yang terpapar kebisingan >85 dB di tempat kerja berisiko terhadap gangguan pendengaran akibat bising (Aditama & Hastuti, 2002).

Pada pertemuan konsultasi WHO-SEARO (South East Asia Regional Office) Intercountry Meeting (2002), menyebutkan bahwa kebisingan merupakan salah satu yang menjadi masalah utama dalam penyebab terjadinya gangguan pendengaran di Indonesia. Gangguan pendengaran akibat bising lingkungan kerja (ONIHL/Occupational Noise-Induced Hearing Loss) menduduki proporsi terbanyak dibandingkan gangguan akibat bising lainnya (Bashiruddin & Soetirto, 2007).

WHO memperkirakan di tahun 2001 terdapat 250 juta orang di dunia mengalami kecacatan gangguan pendengaran yang sedang ataupun berat, angka ini meningkat menjadi lebih dari 275 juta orang di tahun 2004. Dari jumlah tersebut 80% diantaranya terdapat di negara berkembang. Angka ini terus meningkat sejak penelitian pertama kali yang dilakukan oleh WHO pada tahun 1986 (WHO, 2006).

Berdasarkan survei multi center study di Asia Tenggara pada tahun 1998, Indonesia termasuk 4 negara dengan prevalensi ketulian yang cukup tinggi yaitu 4.6%, sedangkan 3 negara lainnya yakni Sri Lanka 8.8%, Myanmar 8.4% dan India 6.3%. Walaupun bukan yang tertinggi tetapi prevalensi 4.6% tergolong cukup tinggi, sehingga hal ini dapat menimbulkan masalah sosial di tengah masyarakat (Suwento, 2007).

Gangguan pendengaran akibat bising/GPAB (Noise Induced Hearing Loss/NIHL) ialah gangguan pendengaran yang disebabkan akibat terpajan oleh bising yang cukup keras dalam jangka waktu yang cukup lama dan biasanya diakibatkan oleh bising lingkungan kerja (Bashiruddin & Soetirto, 2007).

GPAB seharusnya dapat dicegah. Upaya untuk itu telah dilakukan dengan dicanangkan suatu program strategi kebijakan WHO, Sound Hearing 2030. Langkah selanjutnya melalui pembentukan Komite Pusat Penanggulangan Gangguan Pendengaran dan Ketulian (PGPKT) di Indonesia yang menetapkan bahwa GPAB merupakan salah satu target penurunan prevalensi kejadian gangguan pendengaran di masyarakat (Soetjipto, 2007).

Sejauh ini telah banyak studi dilakukan, baik epidemiologi maupun eksperimental, berbagai bukti empirik telah didapatkan dan berbagai teori telah diajukan untuk mendapatkan penjelasan GPAB sampai di tingkat molekuler. Pada kenyataannya sampai saat ini belum ada obat yang dapat digunakan sebagai landasan secara biologi molekuler dalam tindakan preventif dan protektif terhadap dampak pajanan bising yang dapat berakibat pada gangguan pendengaran (Cappaert, et al., 2000; Altschuler, Fairfield & Cho, 2002; Liberman & Hirose, 2003; Le Prell, 2003; Henderson, et al., 2006).

Pada penelitian terakhir ditemukan bahwa adanya peranan jaringan penyangga pada dinding lateral koklea yang mengakibatkan gangguan pendengaran akibat pajanan bising walaupun tanpa disertai kerusakan sel sensoris, sel rambut luar dan stereosilia (Purnami, 2009).

Dinding lateral koklea tersusun dari jaringan matriks ekstraseluler sebagai struktur penyangga, dimana terdapat fibroblas yang menghasilkan kolagen. Fibroblas peka terhadap stimulus bising yang berlebihan secara kontinyu dan jangka panjang. Perubahan yang terjadi

pada fibroblas berpengaruh pada kolagen dan dapat mengganggu fungsi pendengaran. Studi sebelumnya mendapatkan kerusakan pada Kolagen Tipe IV selain Tipe II. Kolagen Tipe IV disebut paling rawan (the most vulnerable) terhadap efek bising, sehingga kerusakan terjadi lebih dominan (Purnami, 2009).

Pajanan bising mengakibatkan stres seluler yang selanjutnya memicu aktivitas chaperon dan mengaktifkan jalur inflamasi sinyal berikutnya (Wang, Hirose & Liberman, 2002; Hirose & Liberman, 2003; Purnami, 2009). Matriks ektraseluler yang berfungsi mempertahankan elastisitas membrana basalis terletak dalam organ Corti, mempunyai peran penting dalam proses transduksi suara. Pada keadaan pajanan bising yang berlebihan akan mempengaruhi fibroblas koklea, terjadi peningkatan permeabilitas membran sel dan memicu peningkatan Ca2+ intraseluler (Purnami, 2009). Peningkatan Ca2+ yang berlebihan dalam sel tersebut akan memicu kematian sel dan mengaktifkan jalur sinyal intraseluler. Aktivasi gen HSF-1 meningkatkan HSP-70 yang merupakan famili molekul chaperon, dimana pada kadar tertentu berperan sebagai proteksi sel untuk mempertahankan homeostasis terhadap pengaruh stres (Le Prell, 2003; Purnami, 2009).

HSP-70 dapat sebagai ligan agonis pada TLR-2 dan TLR-4 dalam meneruskan sinyal intraseluler dengan aktivasi reseptor transmembran dan meneruskan sinyal selanjutnya pada molekul efektor di bawahnya. HSP-70 ekstrasel (eHSP-70) mengaktifkan NFκB di permukaan sel dan mengaktivasi NFκB (30 menit) dan meregulasi ekspresi sitokin pro inflamasi dalam human monosit (2 jam setelah pajanan). Molekul eHSP-70 merupakan mediator dalam produksi sitokin pro inflamasi (Asea, 2005; Calderwood, et al., 2007, Purnami, 2009).

Molekul TNF-α sebagai faktor kemotaktik berfungsi menarik monosit bergerak menuju daerah inflamasi sehingga sel radang terakumulasi (Purnami, 2009). Kumpulan sel radang tersebut akan memicu peningkatan ekspresi MMP-9 yang mampu untuk mendegradasi Kolagen Tipe IV (Vaday & Lider, 2000; Purnami, 2009). Jalur tersebut memungkinkan terjadi suatu proses inflamasi yang berlangsung secara berkepanjangan (prolonged inflammation lesion) (Altschuler, Fairfield & Cho, 2002; Purnami, 2009). Jalur tersebut akan mempengaruhi progresivitas kelainan koklea, dipengaruhi oleh besar kecil intensitas dan lama waktu pajanan. Perubahan tingkat molekuler koklea tersebut timbul pada sel yang mengalami distress, terkait dengan mekanisme mikromekanik dan metabolik yang mengarah pada GPAB (Sliwinska & Jadlinska, 1998; Purnami, 2009).

Curcumin adalah zat pigmen kuning yang diekstrak dari rimpang yang umumnya berasal dari spesies Curcuma longa L. (kunyit) (Lao, et al., 2006; Shim, et al., 2001) dan Curcuma xanthorrhiza Roxb (temulawak).

Kunyit (Curcuma domestica Val.) dengan sinonim Curcuma longa L. termasuk salah satu tanaman rempah yang berasal dari wilayah Asia terutama Asia Tenggara. Di Asia, kunyit telah digunakan sebagai obat sejak tahun 2000 SM. Penggunaan kunyit dalam dunia kedokteran meningkat pesat setelah ditemukannya senyawa fenolik yang biasa disebut curcuminoid. Curcumin merupakan senyawa yang paling banyak dipelajari karena paling banyak mempunyai aktivitas biologis. Selain mempunyai efek anti inflamasi biasa juga sebagai antioksidan dan anti HIV. Pada penelitian secara in vivo dan in vitro, curcumin mempunyai sifat menginhibisi metabolisme asam arakidonat, aktivitas siklooksigenase dan

NFκB. Saat ini produk alami seperti ekstrak buah-buahan dan sayur-sayuran yang sangat diminati untuk digunakan sebagai pencegahan oleh karena produk ini lebih dapat ditoleransi oleh tubuh walaupun dalam konsentrasi yang tinggi (Surh, et al., 2001; Wright, 2002; Hong, et al., 2004).

Kunyit mengandung 3 curcuminoid aktif yang utama yaitu curcumin, bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin. Mereka memiliki klasifikasi ilmiah yang sama dan dilaporkan memiliki efek anti inflamasi dan efek terapeutik. Mekanisme proteksi terhadap inflamasi dan kerusakan oksidatif membuat curcumin sebagai agen alami dalam melawan kerusakan jaringan. Curcumin ini dapat menurunkan regulasi ekspresi sitokin seperti IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 dan kemokin, juga berperan pada supresi aktifasi NFκB (Thaloor, et al., 1999; Johnson & Mattia, 2006; Wyke, Russell & Tisdale, 2004). NFκB adalah faktor transkripsi yang diperlukan untuk

ekspresi gen termasuk proliferasi sel, invasi sel, metastasis, angiogenesis dan resistensi kemoterapi. Faktor ini teraktivasi oleh respon stimulus inflamasi, karsinogen, tumor promotor dan hipoksia yang sering berada di dalam jaringan tumor. Curcumin menginduksi penurunan regulasi NFκB melalui supresi aktivasi Inhibitor kappa B (IκB) kinase, menghambat fosforilasi dan berlanjut pada degradasi IKB (Wyke, Russell & Tisdale,

2004).

Curcumin telah terbukti mengganggu jalur sinyal beberapa sel, termasuk siklus sel (cyclin D1 dan cyclin E), apoptosis (aktivasi caspases dan “down-regulation” dari produk gen anti apoptosis), proliferasi (HER-2, EGFR dan AP-1), kelangsungan hidup (jalur PI3K/AKT), invasi (MMP-9 dan molekul adhesi), angiogenesis (VEGF), metastasis (CXCR-4) dan peradangan (NFκB, TNF, IL-6, IL-1, COX-2 dan 5-LOX) (Anand, et al., 2008).

Dari data yang ada menunjukkan bahwa curcumin menunjukkan efek protektif melawan beberapa bentuk toksin melalui mekanisme yang membedakan peningkatan HSP-70 di hepar dan intestinal dan inhibisi aktivasi reseptor arylhydrocarbon (Ishida, et al., 2004).

Curcumin memiliki efek protektif terhadap cedera hepatic warm ischemia/reperfusion (I/R). Mekanismenya mungkin berhubungan dengan peningkatan ekspresi HSP-70 dan enzim antioksidan (Shen, et al., 2007).

Peningkatan titer TLR-4, MyD88, dan protein NFκB dalam jaringan yang mengalami inflamasi juga dapat ditekan secara signifikan dengan pemberian curcumin. Dalam penelitian, dibuktikan bahwa curcumin dapat menginhibisi proses inflamasi yang disebabkan TLR-4 dan MyD88 (Lubbad, Oriowo & Khan, 2009).

Hasil terapi curcumin tidak hanya menunjukkan penurunan signifikan pada ekspresi MMP-2 dan MMP-9, tetapi juga mengakibatkan inhibisi dari kemampuan invasif in vitro. Curcumin juga mempengaruhi penurunan ukuran tumor, aktivitas MMP-2 dan MMP-9 pada daerah tumor (Hong, et al., 2004).

Produksi kolagen meningkat dan produksi matriks metalloptoteinase-9 (MMP-9) menurun pada kulit tikus yang baru sembuh yang diobati dengan curcumin dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan Temovate (Bhagavathula, et al., 2009)

Curcumin secara signifikan dapat meningkatkan Kolagen Tipe IV dan III dalam supernatan sel mesangial yang diinduksi oleh LPS. Curcumin menurunkan ekspresi IL-1 beta. Curcumin juga dapat menghambat proliferasi sel mesangial manusia dan mengubah perputaran matriks ekstraselular, sementara itu curcumin juga dapat menurunkan IL-1 beta dan ekspresi MCP-1 mRNA yang diinduksi LPS (Bao, et al., 2003).

Bising merupakan campuran suara yang memiliki frekuensi bervariasi dari yang rendah ke tinggi. Pada penelitian ini dipilih frekuensi bising dengan rentang 1 kHz sampai dengan 10 kHz berdasarkan pertimbangan karakteristik bising yang dipengaruhi oleh rentang sensitivitas kemampuan penangkapan indra pendengaran manusia dan tikus (Heffner, 2007). Dosis pajanan bising yang diberikan adalah 100 dB SPL selama 2 jam karena didapati perbedaan ekspresi protein yang bermakna untuk HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan Kolagen Tipe IV pada dosis tersebut (Purnami, 2009).

Eksperimen menggunakan tikus sebagai hewan coba. Hal ini dilakukan sehubungan dengan prosedur perlakuan dan pemeriksaan akhir yang berakibat fatal.

Penelitian ini menggunakan curcuminoid yang berasal dari Curcuma longa L. karena diharapkan curcuminoid dapat mengobati

bahkan mencegah kerusakan fibroblas koklea sebagai sel yang mengalami stres akibat diberi pajanan bising.

Berdasarkan berbagai masalah tersebut di atas dan dengan adanya prevalensi GPAB yang cukup tinggi, dapat mengenai segala usia yang lebih muda yaitu golongan usia produktif, maka GPAB merupakan masalah global yang sangat perlu mendapatkan perhatian besar.

Metode pencegahan yang tepat perlu dipikirkan dengan harapan target dari upaya penurunan prevalensi GPAB dapat segera terpenuhi. Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam upaya menemukan langkah preventif GPAB secara biologi molekuler yang pada akhirnya ditujukan untuk menurunkan secara klinis angka prevalensi GPAB.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah yang sudah diuraikan, dapat dirumuskan permasalahan yang dituangkan sebagai pertanyaan penelitian sebagai berikut:

1.2.1 Apakah curcuminoid dapat mencegah kerusakan fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHZ pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam berdasarkan penurunan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 dan MMP-9.

1.2.2 Apakah curcuminoid dapat mencegah kerusakan fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHZ pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam berdasarkan peningkatan Kolagen Tipe IV. 1.2.3 Apakah curcuminoid 100 mg perhari lebih baik dari curcuminoid 50

mg perhari dalam mencegah kerusakan fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHZ pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam berdasarkan penurunan ekspresi HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4 dan MMP-9.

1.2.4 Apakah curcuminoid 100 mg perhari lebih baik dari curcuminoid 50 mg perhari dalam mencegah kerusakan fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam berdasarkan peningkatan ekspresi Kolagen Tipe IV.

1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan umum

Membuktikan curcuminoid sebagai fitofarmaka yang efektif dan aman untuk mencegah kerusakan fibroblas koklea akibat efek pajanan bising. 1.3.2 Tujuan khusus

1. Membuktikan curcuminoid dapat menurunkan ekspresi HSP-70 pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

2. Membuktikan curcuminoid dapat menurunkan ekspresi NFκB pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

3. Membuktikan curcuminoid dapat menurunkan ekspresi TLR-2 pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

4. Membuktikan curcuminoid dapat menurunkan ekspresi TLR-4 pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

5. Membuktikan curcuminoid dapat menurunkan ekspresi MMP-9 pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

6. Membuktikan curcuminoid dapat meningkatkan ekspresi Kolagen Tipe IV pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

7. Membuktikan curcuminoid dosis 100 mg perhari lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg perhari untuk menurunkan ekspresi HSP-70 pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

8. Membuktikan curcuminoid dosis 100 mg perhari lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg perhari untuk menurunkan ekspresi NFk

9. Membuktikan curcuminoid dosis 100 mg perhari lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg perhari untuk menurunkan ekspresi TLR-2 pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

B pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

10. Membuktikan curcuminoid dosis 100 mg perhari lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg perhari untuk menurunkan ekspresi TLR-4 pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

11. Membuktikan curcuminoid dosis 100 mg perhari lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg perhari untuk menurunkan ekspresi MMP-9 pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

12. Membuktikan curcuminoid dosis 100 mg perhari lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg perhari untuk meningkatkan ekspresi Kolagen Tipe IV pada fibroblas koklea yang diberi pajanan bising frekuensi 1-10 kHz pada intensitas 100 dB SPL selama 2 jam.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Mendapatkan penjelasan perubahan ekspresi molekuler fibroblas koklea akibat pajanan bising yang diterapi dengan curcuminoid. 1.4.2 Jika sudah terbukti pada hewan percobaan, diharapkan

curcuminoid ini mampu mencegah dan berpotensi dalam perbaikan fibroblas koklea manusia yang diberi pajanan bising, sehingga dari hasil tersebut curcuminoid dapat dimanfaatkan oleh masyarakat luas sebagai fitofarmaka untuk mencegah dan mengobati GPAB. 1.4.3 Memberi informasi kepada pengampu kebijakan dan masyarakat

untuk memanfaatkan curcuminoid sebagai obat fitofarmaka yang berpotensi mengobati dan mencegah kerusakan fibroblas koklea yang diharapkan kelak dapat mencegah dan mengobati GPAB.

1.5 Orisinalitas

Berdasarkan penelusuran secara kepustakaan, peneliti belum menemukan penelitian tentang curcuminoid yang berasal dari Curcuma longa L. dapat berpotensi mengobati dan mencegah kerusakan fibroblas koklea akibat pajanan bising melalui mekanisme seluler berdasarkan efek sebagai inhibitor HSP-70, NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 ataupun peningkatan Kolagen Tipe IV.

1.6 Potensi Hak Atas Kekayaan Intelektual (HAKI)

Curcuminoid dapat berpotensi mengobati dan mencegah kerusakan fibroblas koklea pada hewan percobaan Rattus norvegicus melalui mekanisme preventif dan protektif yaitu sebagai berikut:

1.6.1 Curcuminoid mampu menurunkan ekspresi HSP-70 pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.2 Curcuminoid mampu menurunkan ekspresi NFκB pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.3 Curcuminoid mampu menurunkan ekspresi TLR-2 pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.4 Curcuminoid mampu menurunkan ekspresi TLR-4 pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.5 Curcuminoid mampu menurunkan ekspresi MMP-9 pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.6 Curcuminoid mampu meningkatkan ekspresi Kolagen Tipe IV pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.7 Curcuminoid dosis 100 mg lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg dalam menurunkan ekspresi HSP-70 pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.8 Curcuminoid dosis 100 mg lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg dalam menurunkan ekspresi NFκB pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.9 Curcuminoid dosis 100 mg lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg dalam menurunkan ekspresi TLR-2 pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.10 Curcuminoid dosis 100 mg lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg dalam menurunkan ekspresi TLR-4 pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.11 Curcuminoid dosis 100 mg lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg dalam menurunkan ekspresi MMP-9 pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

1.6.12 Curcuminoid dosis 100 mg lebih baik dibanding curcuminoid dosis 50 mg dalam meningkatkan ekspresi Kolagen Tipe IV pada fibroblas koklea Rattus norvegicus.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi

Gangguan pendengaran akibat bising/GPAB (Noise-Induced Hearing Loss/NIHL) adalah bentuk permanen dari ketulian yang muncul akibat paparan suara yang keras. Setelah paparan tunggal, terjadi perubahan temporer pada pendengaran yang reversible, tetapi jika suara cukup kuat atau diulang, bisa timbul tuli permanen irreversible, yang mengarah pada pergeseran ambang pendengaran permanen (Thorne, 2011; American Hearing Research Foundation, 2012).

Paparan kebisingan dapat menyebabkan pergeseran ambang batas pendengaran yang bersifat sementara (temporary threshold shift/TTS) atau permanen (permanent threshold shift/PTS), tergantung pada intensitas dan durasi suara. Rentang waktu dari kerusakan sementara dapat beberapa hari atau bahkan minggu setelah paparan kebisingan. Selama 16-48 jam setelah paparan kebisingan, umumnya akan terjadi pemulihan jika kondisi dan kerusakan tidak terlalu parah. Jika tidak dapat pulih dalam jangka waktu beberapa minggu, kerusakan akan bersifat permanen dan sel-sel akan mati, menghasilkan pergeseran ambang batas permanen (Attias, et al., 2004; Adelman, et al., 2008; Nelson, 2009).

Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 1

The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values

Perlakuan 8 K1 K2 K3A K3B K4A K4B K5A K5B

Number of observations 40

Data Amatan 01:31 Saturday, March 2, 2013 2

The GLM Procedure Dependent Variable: HSP70

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001 Error 32 84.000000 2.625000

Corrected Total 39 1401.775000

R-Square Coeff Var Root MSE HSP70 Mean 0.940076 21.82068 1.620185 7.425000

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1317.775000 188.253571 71.72 <.0001

Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 122.2321429 122.2321429 46.56

K2 VS K3 1 208.0333333 208.0333333 79.25

K2 VS K4 1 896.5333333 896.5333333 341.54

K2 VS K5 1 710.5333333 710.5333333 270.68

K3A VS K3B 1 8.1000000 8.1000000 3.09

K4A VS K4B 1 25.6000000 25.6000000 9.75

K5A VS K5B 1 40.0000000 40.0000000 15.24

Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B 0.0885 K4A VS K4B 0.0038 K5A VS K5B 0.0005

Dependent Variable: MMP9

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 1594.700000 227.814286 84.38 <.0001 Error 32 86.400000 2.700000

Corrected Total 39 1681.100000

R-Square Coeff Var Root MSE MMP9 Mean 0.948605 16.68191 1.643168 9.850000

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1594.700000 227.814286 84.38 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1594.700000 227.814286 84.38 <.0001

Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 388.9285714 388.9285714 144.05

K2 VS K3 1 120.0000000 120.0000000 44.44

K2 VS K4 1 374.5333333 374.5333333 138.72

K2 VS K5 1 662.7000000 662.7000000 245.44

K3A VS K3B 1 250.0000000 250.0000000 92.59

K4A VS K4B 1 40.0000000 40.0000000 14.81

K5A VS K5B 1 136.9000000 136.9000000 50.70

Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B 0.0005 K5A VS K5B <.0001

Dependent Variable: TLR2

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 820.7750000 117.2535714 34.74 <.0001 Error 32 108.0000000 3.3750000

Corrected Total 39 928.7750000

R-Square Coeff Var Root MSE TLR2 Mean 0.883718 20.24372 1.837117 9.075000

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 820.7750000 117.2535714 34.74 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 820.7750000 117.2535714 34.74 <.0001

Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 225.0035714 225.0035714 66.67

K2 VS K3 1 2.7000000 2.7000000 0.80

K2 VS K4 1 168.0333333 168.0333333 49.79

K2 VS K5 1 154.1333333 154.1333333 45.67

K3A VS K3B 1 22.5000000 22.5000000 6.67

K4A VS K4B 1 108.9000000 108.9000000 32.27

K5A VS K5B 1 115.6000000 115.6000000 34.25

Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 0.3778 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B 0.0146 K4A VS K4B <.0001 K5A VS K5B <.0001

Dependent Variable: TLR4

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 2028.175000 289.739286 130.22 <.0001 Error 32 71.200000 2.225000

Corrected Total 39 2099.375000

R-Square Coeff Var Root MSE TLR4 Mean 0.966085 15.49759 1.491643 9.625000

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 2028.175000 289.739286 130.22 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 2028.175000 289.739286 130.22 <.0001

Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 298.289286 298.289286 134.06

K2 VS K3 1 100.833333 100.833333 45.32

K2 VS K4 1 1068.033333 1068.033333 480.01

K2 VS K5 1 546.133333 546.133333 245.45

K3A VS K3B 1 168.100000 168.100000 75.55

K4A VS K4B 1 0.900000 0.900000 0.40

K5A VS K5B 1 160.000000 160.000000 71.91

Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B 0.5293 K5A VS K5B <.0001

Dependent Variable: NFkBp65

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 1717.975000 245.425000 48.96 <.0001 Error 32 160.400000 5.012500

Corrected Total 39 1878.375000

R-Square Coeff Var Root MSE NFkBp65 Mean 0.914607 20.12460 2.238861 11.12500

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1717.975000 245.425000 48.96 <.0001

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 1717.975000 245.425000 48.96 <.0001

Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 415.2892857 415.2892857 82.85

K2 VS K3 1 67.5000000 67.5000000 13.47

K2 VS K4 1 472.0333333 472.0333333 94.17

K2 VS K5 1 464.1333333 464.1333333 92.60

K3A VS K3B 1 62.5000000 62.5000000 12.47

K4A VS K4B 1 324.9000000 324.9000000 64.82

K5A VS K5B 1 176.4000000 176.4000000 35.19

Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 0.0009 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B 0.0013 K4A VS K4B <.0001 K5A VS K5B <.0001

Dependent Variable: Kolagen4

Sum of

Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 7 2545.575000 363.653571 99.97 <.0001 Error 32 116.400000 3.637500

Corrected Total 39 2661.975000

R-Square Coeff Var Root MSE Kolagen4 Mean 0.956273 10.91401 1.907223 17.47500

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 2545.575000 363.653571 99.97 <.0001 Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F Perlakuan 7 2545.575000 363.653571 99.97 <.0001

Contrast DF Contrast SS Mean Square F Value

K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B 1 104.432143 104.432143 28.71

K2 VS K3 1 512.533333 512.533333 140.90

K2 VS K4 1 1020.833333 1020.833333 280.64

K2 VS K5 1 1080.000000 1080.000000 296.91

K3A VS K3B 1 160.000000 160.000000 43.99

K4A VS K4B 1 36.100000 36.100000 9.92

K5A VS K5B 1 960.400000 960.400000 264.03

Contrast Pr > F K1 VS K2 & K3A & K3B & K4A & K4B & K5A & K5B <.0001 K2 VS K3 <.0001 K2 VS K4 <.0001 K2 VS K5 <.0001 K3A VS K3B <.0001 K4A VS K4B 0.0035 K5A VS K5B <.0001