3.7 Prosedur Penelitian
3.7.1 Tahap persiapan Untuk menjamin bahwa semua prosedur yang dilakukan pada
penelitian ini laik etik, maka sebelum dilakukan penelitian proposal diajukan terlebih dahulu pada komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara untuk mendapatkan penilaian dan pengesahan kelaikan etik.
3.7.2 Prosedur pengukuran intensitas kebisingan Sebelum perlakuan pada tikus dimulai, dipersiapkan alat pemajan
kebisingan terlebih dahulu, yaitu dengan tahapan sebagai berikut: a. Compact Disc CD sesuai dengan lama pajanan yang dikehendaki
dipasang pada CD player. Tombol amplifier diatur sesuai dengan intensitas yang diperlukan.
b. Sound level meter dipersiapkan untuk mengukur intensitas pada kotak perlakuan, diatur pada skala weighting A dan intensitas yang sesuai
dengan yang akan diukur. c. Kotak perlakuan terbuat dari gabus dilapis oleh busa, speaker
diletakkan menempel pada atap penutup kotak dan dasar kotak dibuat lubang untuk pengukur intensitas, diukur pada delapan titik dimana
kandang tikus akan ditempatkan dan perbedaan intensitas tidak melebihi 1 dB.
Universitas Sumatera Utara
d. Pengukuran intensitas dimulai dengan menyalakan CD player dan mengatur tombol intensitas di amplifier sehingga didapatkan intensitas
yang diinginkan dan ukur pada kotak perlakuan dengan menggunakan sound level meter.
e. Setelah mendapatkan intensitas yang diinginkan CD player dimatikan kembali.
f. Penelitian dimulai dengan memasukkan kelompok perlakukan tikus ke dalam kotak pemajan kebisingan yang sudah terukur intensitasnya.
Setiap perlakuan memiliki perwakilan dari masing-masing kelompok. 3.7.3 Prosedur pemberian curcuminoid
Curcuminoid kadar curcuminoid [28.1 ± 1.0] bb dosis 50 mg dan
100 mg disuspensikan dalam Carboxy Methyl Cellulose CMC 0.5 CMC dibuat dengan mensuspensikan 0.5 gram CMC dalam 100 cc
larutan akuades. Setelah disuspensikan, diberikan langsung ke lambung tikus dengan menggunakan Naso Gastric Tube NGT.
3.7.4 Perlakuan pada tikus Setelah tikus putih beradaptasi terhadap lingkungan kandang di
laboratorium selama 2 minggu, selanjutnya perlakuan diberikan sesuai dengan kelompok yang direncanakan.
Universitas Sumatera Utara
3.7.5 Prosedur pengambilan jaringan koklea tikus Tikus dikorbankan dengan inhalasi eter, dilakukan nekropsi jaringan
tulang temporal kepala tikus. Sampel jaringan diambil, difiksasi dengan larutan buffer formalin 10 dan dilakukan dekalsifikasi dengan EDTA
selama 4 minggu. Selanjutnya dilakukan pemeriksaan laboratorium. 3.7.6 Pemeriksaan laboratorium
a. Fiksasi jaringan dengan pembuatan paraffin block jaringan. Jaringan tulang dilakukan dekalsifikasi dengan menggunakan EDTA
selama 4 minggu. Jaringan dicuci dengan PBS 3-5x untuk membersihkan dari kontaminan. Kemudian difiksasi pada formalin
10. Setelah itu dilakukan dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat 30, 50, 70, 80, 96 dan absolut masing-masing 60 menit.
Dilakukan clearing menggunakan xylol 2 kali masing-masing 60 menit. Kemudian dilakukan infiltrasi dengan parafin lunak selama 60 menit
pada suhu 48 C. Selanjutnya dilakukan block dalam parafin keras
pada cetakan dan didiamkan selama sehari. Keesokan harinya ditempelkan pada holder dan dilakukan pemotongan setebal 4 µm
dengan rotary microtome. Dilakukan mounting pada gelas objek dengan gelatin 5.
Universitas Sumatera Utara
b. Proses deparafinisasi Gelas obyek hasil paraffin block direndam dalam xylol 2 kali masing-
masing selama 5 menit. Setelah itu dilakukan rehidrasi menggunakan alkohol berseri absolut, 96, 80, 70, 50 dan 30 masing-
masing selama 5 menit. Kemudian dibilas dalam dH
2
O selama 5 menit.
c. Proses pewarnaan Hematoxilin Eosin Slide
dicuci dengan PBS pH 7.4 selama 5 menit. Kemudian diwarnai dengan Hemotoxilin selama 10 menit. Setelah itu direndam dalam tap
water selama 10 menit. Kemudian dibilas dengan dH
2
O. Dilakukan dehidrasi dengan alkohol berseri 30 dan 50 masing-masing
selama 5 menit. Kemudian diwarnai dengan larutan Eosin selama 3 menit. Selanjutnya dibilas dengan alkohol 30. Dicuci dengan dH
2
Slide dicuci dengan PBS pH 7.4 satu kali selama 5 menit. Blocking
endogenous peroksida menggunakan 3 H
O selama 5 menit dan dikering anginkan. Kemudian dilakukan mounting
dengan entelan dan tutup dengan cover glass. d. Pengamatan ekspresi HSP-70,
NFκB, TLR-2, TLR-4, MMP-9 dan Kolagen Tipe IV dengan teknik Imunohistokimia.
2
O
2
selama 20 menit. Cuci menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali, selama 5 menit. Blocking
unspecific protein menggunakan 5 FBS yang mengandung 0.25
Triton X-100. Cuci menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali, selama 5 menit. Inkubasi menggunakan antibodi primer, selama 60 menit. Cuci
menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali, selama 5 menit. Inkubasi
Universitas Sumatera Utara
menggunakan anti rabbit HRP conjugated selama 40 menit. Cuci menggunakan PBS pH 7.4 tiga kali, selama 5 menit. Tetesi dengan
DAB Diamino Benzidine dan inkubasi selama 10 menit. Cuci menggunakan dH
2
O, selama 5 menit. Counterstaining menggunakan Mayer Hematoxilin yang diinkubasi selama 10 menit dan cuci
menggunakan tap water. Bilas menggunakan dH
2
1. Penghitungan dilakukan terhadap semua slide yang ada dengan rincian:
O dan kering anginkan. Mounting menggunakan entelan dan tutup dengan cover
glass . Terakhir diamati pada mikroskop cahaya.
3.7.7 Penghitungan sel Menggunakan mikroskop Nikon Eclipse 100 dengan 20x0.75 dan
40x1.2. Penghitungan jumlah fibroblas terekspresi dilakukan oleh peneliti dan pengamat kedua.
a. Jumlah hewan coba yang termasuk kriteria masukan 40 sampel b. Setiap hewan coba diambil sampel jaringan, difiksasi dengan 10
formalin, dilakukan dekalsifikasi dengan EDTA selama 4 minggu c. Masing-masing sampel jaringan dibuat sediaan irisan setebal
4 µm, kemudian diwarnai dengan: •
Hematoxilin Eosin HE •
Imunohistokimia terhadap HSP-70, NF κB, TLR-2, TLR-4,
MMP-9 dan Kolagen Tipe IV
Universitas Sumatera Utara
2. Semua slide yang sudah berkode ditutup nomor kodenya dan diberi nomor baru secara acak sehingga pemeriksa dan peneliti yang ikut
memeriksa tidak mengetahui slide yang diperiksa milik sampel yang mana double blind
3. Pemeriksa terdiri dari 2 orang, masing-masing yaitu peneliti dan pemeriksa
4. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan secara terpisah diantara ke 2 pemeriksa, disesuaikan dengan kemampuankesediaan waktu
pemeriksa 5. Pemeriksaan dan penghitungan sel dilakukan terhadap masing-
masing slide pada bidang pandang di dinding lateral koklea yaitu daerah yang ditandai dengan adanya fibroblas dengan pembesaran
1000x, masing-masing sebanyak 20 lapangan pandang 6. Hasil penghitungan sel untuk setiap lapangan pandang sesuai dengan
slide yang diperiksa ditulis di lembar kerja pada kotak yang sesuai dan
hasil akhirnya dijumlah pada kotak kanan bawah 7. Untuk sediaan dengan pengecatan HE digunakan sebagai
pembanding struktural dari sediaan 8. Analisis statistik dilakukan bila semua hasil sudah dikembalikan ke
nomor kode
Universitas Sumatera Utara
9. Untuk menjamin representasi dan mengurangi kesalahan hasil, diperlukan pengamatan kurang lebih sejumlah 20 lapangan pandang
pembesaran 1000x yang masing-masing berisi kurang lebih 50-60 sel per lapangan pandang Soini, Paakko Lehto 1998; Pizem Cor,
2003
3.8 Alur Penelitian
Kategori