Metode Evaluasi Sifat Prebiotik

3 Dapat menjadi substrat yang selektif untuk pertumbuhan bakteri probiotik di usus besar contohnya: Bifidobacterium bifidum maupun L. plantarum. 4 Tidak dapat dimanfaatkan untuk pertumbuhan bakteri enteropatogenik. Di samping itu prebiotik juga tidak diijinkan mengandung kontaminan dan impuritis sehingga perlu mendapatkan status GRAS Generally Recognized As Safe atau setaranya Toma dan Pokrotnieks 2006. Pati resisten termasuk molekul yang mempunyai panjang rantai derajat polimerisasi lebih pendek. Panjang rantai ini sangat berhubungan dengan kecepatan fermentasi. Roberfroid 2007 menjelaskan bahwa derajat polimerisasi suatu oligosakarida seperti kelompok β- fruktan memberikan pengaruh yang nyata terhadap kecepatan fermentasi secara in-vitro. Molekul dengan derajat polimerisasi DP kurang dari 10 seperti inulin akan difermentasi dua kali lebih cepat daripada molekul yang mempunyai DP lebih dari 10 yaitu pati resisten RS Huebner et al. 2007. Nurhayati et al. 2014 melaporkan bahwa RS3 dari tepung pisang modifikasi terbukti dapat memenuhi beberapa persyaratan sebagai komponen prebiotik meliputi ketahanannya terhadap hidrolisis asam lambung, mampu meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus dan Bifidobacteria, menurunkan pertumbuhan bakteri patogen, menghasilkan asam lemak rantai pendek terutama asam butirat dan memiliki indeks prebiotik lebih tinggi daripada RS2 tepung pisang kontrol. RS3 juga bersifat spesifik untuk meningkatkan pertumbuhan Lactobacillus acidophilus dan mampu menghambat pertumbuhan beberapa bakteri enteropatogenik seperti Entero Pathogenic Escherechia coli EPEC dan Salmonella typhimurium. Selain RS pada tepung pisang modifikasi, RS pati jagung yang dihasilkan dari proses modifikasi secara kimia dapat menstimulasi pertumbuhan Bifidobacteria sehingga merupakan prebiotik yang sangat potensial Mun dan Shin 2006. RS3 dari gandum, kentang dan kacang polong juga dapat menstimulasi pertumbuhan bifidobakteria yaitu Bifidobacteria pseudolongum KSI9, B. breve KN14 dan B. animalis KS20a1 Wronkowska et al. 2006.

2.8. Metode Evaluasi Sifat Prebiotik

Menurut FAO 2015 evaluasi sifat prebiotik harus didasarkan pada penelitian dan metode ilmiah yang representatif dan akurat, serta aman jika prebiotik tersebut dikonsumsi. Pengaruh prebiotik terhadap pertumbuhan probiotik dinyatakan sebagai efek prebiotik maupun indeks prebiotik yang dihitung berdasarkan jumlah total koloni bakteri probiotik log cfumL Huebner et al. 2007. Peningkatan nilai indeks prebiotik maupun efek prebiotik mengindikasikan terjadinya peningkatkan populasi bakteri probiotik seperti Lactobacillus sp dan Bifidobacterium sp. ketika ditumbuhkan dalam sumber prebiotik Manderson et al. 2005, Roberfroid 2007. Beberapa metode pengujian sifat prebiotik dapat dilihat pada Tabel 6. Efek prebiotik adalah meningkatnya populasi bakteri probiotik secara absolut tanpa mempertimbangkan konsentrasi prebiotik. Sementara itu Indeks prebiotik adalah peningkatan populasi bakteri probiotik yang dikorelasikan dengan konsentrasi prebiotik Roberfroid 2007. Peningkatan efek prebiotik bahan pangan akan berpengaruh nyata terhadap peningkatan indeks prebiotiknya sebagaimana dilaporkan Heubner et al. 2007. Vrese dan Marteau 2007 melaporkan bahwa bahan pangan dinyatakan sebagai sumber prebiotik yang baik apabila memiliki nilai efek prebiotik dan indeks prebiotik di atas 2,0. Tabel 6. Beberapa metode evaluasi sifat prebiotik Aktivitas prebiotik adalah kemampuan prebiotik untuk meningkatkan pertumbuhan bakteri probiotik yang dihubungkan dengan selektivitasnya terhadap bakteri patogen Lesmes et al. 2009. Bahan pangan memiliki aktivitas prebiotik positif di atas 0,25 jika dimetabolisme secara selektif oleh bakteri probiotik seperti L. acidophilus dan L. plantarum akan tetapi tidak dimetabolisme oleh bakteri patogen seperti EPEC Vrese dan Marteau 2007. Pengujian ketahanan RS penting dilakukan untuk mengkonfirmasi bahwa RS tidak terhidrolisis selama berinteraksi dengan asam lambung sehingga dapat mencapai kolon dan dapat dimanfaatkan sebagai sumber nutrisi bagi bakteri probiotik seperti yang dipersyaratkan oleh FAO 2007. Robertson et al. 2001 melaporkan bahwa kemampuan RS untuk menstimulasi pertumbuhan bakteri probiotik dapat dievaluasi dengan analisis kadar asam lemak rantai pendek short chain fatty acidSCFA yang dihasilkan selama fermentasi kultur fekal pada media yang mengandung RS3. SCFA sebagai hasil fermentasi RS dapat dianalisis dengan instrument HPLC High Performance liquid Chromatography maupun Metode Referensi Parameter Uji Ketahanan pati resisten RS terhadap cairan lambung secara in-vitro Wicheinchot et al. 2010 Analisis tingkat ketahanan RS terhadap cairan lambung berdasarkan nilai pati resisten yang terhidrolisis selama diberikan perlakuan asam lambung artifisial dengan mengukur kadar gula pereduksi metode DNS dan kadar gula total metode asam sulfat-fenol Persentase pertumbuhan bakteri probiotik dan bakteri patogen dalam media RS Vardakou et al. 2008, Buriti et al. 2010 Analisis persentase peningkatan pertumbuhan bakteri probiotik dan persentase penghambatan bakteri patogen Uji viabilitas BAL dalam RS Kim et al. 2003, Kim JH 2009 Analisis jumlah koloni BAL probiotik yang dapat ditumbuhkan dalam RS dalam CFU mL Analisis Efek Prebiotik, Indeks Prebiotik dan Aktivitas Prebiotik Huebner et al. 2007, Robertfroid et al. 2007 Jumlah logaritmik pertumbuhan Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp,, Clostridium sp., EPEC pada sumber prebiotik untuk setiap peningkatan waktu Analisis Asam Lemak Rantai Pendek SCFA Robertson et al. 2001, Lesmes et al. 2009 Analisis kadar SCFA asam format, asam asetat, asam propionat, asam butirat yang dihasilkan selama fermentasi RS dengan instrument HPLC maupun GC Analisis sifat prebiotik FOS dan inulin pada tikus percobaan Nuraida et al. 2008, Arief et al. 2010 Jumlah koloni BAL L. acidophilus, koloni Salmonella sp. dan koloni Escherechia coli pada feses tikus GC Gas Chromomatography. Analisis HPLC dilakukan melalui injeksi sampel sebanyak 10 l ke HPLC dengan kondisi fase gerak H 2 SO 4 0,01 N, flow 0,5 mlmenit, kolom C18, suhu oven 50 C, detektor UV 210 nm. Standar yang digunakan adalah asam format 0,236 , asam asetat 0,257 , asam propionat 0,3254 dan asam butirat 0,2139 Lesmes et al. 2009. Analisis SCFA dengan instrumen GC Gas Chromomatography dilakukan sebagai berikut: 1 ml sampel hasil kultur fermentasi BAL probiotik, disentrifugasi pada 7000 rpm selama 5 menit, supernatan disaring dengan milipore 0,45 l, kemudian diambil 0,5 l dan diinjeksikan ke dalam sistem kromatografi gas. Instrumen GC yang digunakan adalah merek Shimadzu GC 8, jenis kolom gelas GP 10 SP 1200 on 1 H 3 PO 4 , panjang kolom 2 meter, diameter kolom 3 mm, suhu injector 220 C, suhu kolom 130°C. Jenis detektor Flame Ionisation Detector FID, suhu detektor 220° C, dan tekanan nitrogen N 2 sebagai gas pembawa 1,3 mlcm 2 . Data dari UV detector diintegrasikan menggunakan paket software Value ChromTM. Produksi asam butirat, propionat, asetat dan laktat pada masing-masing sampel dihitung dengan kurva kalibrasi eksternal dengan menggunakan standar asam laktat, asam asetat, asam propionat dan asam butirat Topping dan Clifton, 2001.

3. METODE

3.1. Waktu dan tempat penelitian Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Biokimia Mikroba, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi LIPI, Cibinong Bogor mulai bulan September 2014 sampai dengan bulan Februari 2015. 3.2. Bahan dan alat Bahan baku yang digunakan adalah umbi talas bogor varietas pandan Colocasia esculenta yang diperoleh dari petani di Kecamatan Cijeruk Kabupaten Bogor Propinsi Jawa Barat. Umbi talas dipanen pada bulan ke- 8 ketika kandungan amilosa dan amilopektinnya tinggi Rahmawati et al. 2012. Media dan bahan kimia yang digunakan antara lain: media MRS de Mann Rogosa Sharpe Agar dan Broth, m-MRSB, m-TSB, TSB, TSA, yeast extract Difco, beef extract Difco, bacto agar Difco , enzim α-amilase Sigma A6380, enzim pepsin Sigma P6887, pankreatin Sigma P-1750, enzim amiloglukosidase Sigma A-9913, inulin Sigma I2255, glukosa, maltosa, 3,5-dinitrosalisilat Merck, Na-K-tartarat Merck, fenol Merck, asam sulfat pekat, natrium dodesilsulfat, etanol, aseton, eter, NaCl, CaCO 3 , amonium sitrat, natrium asetat, magnesium sulfat, manganase sulfat, dikalium fosfat, tween 80, NaOH 25 dan 1 N, HCl, akuades, buffer Na fosfat 0,05 M dan 0,01 M pH 6,9 dan pH 7, buffer sodium asetat 0,1 M pH 5,2 dan pH 6,0, dan 0,4 M pH 4,75, buffer HCl-KCl 0,05 M dan 0,1 M pH 1,5 , filter selulosa 0,45 m, kertas saring Whatman No. 41. Alat-alat yang digunakan meliputi: otoklaf Hirayama, spektrofotometer UV-Vis Type 1601 Shimadzu, High Speed Refrigerated Centrifuge Type 6500 Kubota, inkubator Shimadzu, pH meter TOA, pin disc mil Agrowindo, neraca analitik Shimadzu, hot plate, water bath Memmert wnb 14, drying oven Isuzu, lemari pendingin National, tanur Shimadzu, mikropipet Gilson, tip, sudip, magnetic stirer, slicer, blender Phillips, vortex, soxhlet, labu Kjeldahl, labu distilasi dan seperangkat alat gelas. Kultur bakteri Kultur bakteri yang digunakan terdiri dari kultur bakteri untuk starter fermentasi talas dan kultur bakteri untuk evaluasi sifat prebiotik yang diperoleh dari Laboratorium Culture Collection INA-CC Pusat Penelitian Biologi LIPI. Kultur bakteri untuk starter fermentasi diseleksi dari 40 strain isolat BAL asal nira siwalan Borassus flabellifer L. dari kota Kupang, Nusa Tenggara Timur, dan 1 strain Lactobacillus plantarum D-240 yang diisolasi dari sawi asin asal Bogor Indonesia. Sementara itu kultur bakteri untuk evaluasi sifat prebiotik adalah Lactobacillus acidophilus LIPIMC-080, EPEC Entero Pathogenic Escherichia coli LIPIMC-060.