Metodologi penelitian
Penelitian yang dilakukan terdiri dari tiga tahap, yaitu : tahap pertama adalah seleksi BAL penghasil amilase dan pululanase serta aplikasinya dalam fermentasi talas;
tahap kedua yaitu peningkatan kadar RS Tepung Talas Modifikasi TTM dengan fermentasi BAL dan pemanasan bertekanan-pendinginan; tahap ketiga adalah evaluasi
sifat prebiotik TTM kaya RS.
3.4. Tahap 1: Seleksi BAL Penghasil Amilase dan Pululanase serta Aplikasinya dalam Fermentasi Irisan Talas
3.4.1. Seleksi BAL berdasarkan aktivitas amilase, pululanase dan total populasi BAL
3.4.1.1. Persiapan kultur BAL untuk seleksi enzim amilase dan pululanase
Peremajaan dan persiapan kultur murni 41 isolat BAL digunakan media MRSB. Komposisi tiap 1 liter media MRSB adalah 8 gram beef extract, 4 gram
yeast extract, 10 gram pepton, 5 gram sodium asetat, 2 gram dipotasium hidrogen fosfat, 0,2 gram MgSO
4
7 H
2
O, 0,05 gram MnSO
4
4H
2
O, 1 ml tween 80, 20 gram starch soluble, dan 2 gram triamonium sitrat. Persiapan kultur
dilakukan dalam erlenmeyer 100 ml dengan menginokulasikan kultur murni BAL masing-masing ke dalam 50 ml media pertumbuhannya. Selanjutnya
erlenmeyer tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37
C selama 24 jam.
3.4.1.2. Produksi supernatan ekstrak kasar amilase dan pululanase Produksi supernatan ekstrak kasar amilase dilakukan dengan menumbuhkan
isolat BAL 10
8
cfuml, 2 vv ke dalam 25 ml media MRSB Sigma- Aldrich, USA dengan 0,5 bv amilosa Sigma-Aldrich, USA sebagai
sumber karbon utama selama 24 jam pada suhu 37 C. Untuk produksi ekstrak
kasar enzim pululanase, sebanyak 2 kultur BAL 10
8
cfuml ditumbuhkan dalam 25 ml media MRSB Sigma-Aldrich, USA dengan 0.5 bv
amilopektin Sigma-Aldrich, USA sebagai sumber karbon utama selama 24 jam pada suhu 37
C. Untuk menganalisis pertumbuhan isolat BAL selama 24 jam dilakukan analisis plate count dalam media MRSA sehingga dapat diketahui
jumlah total populasi BAL Kim et al. 2008. Ekstrak kasar amilase dan pululanase ekstraseluler dari isolat BAL dalam media MRSB diperoleh dengan
melakukan sentrifugasi 9000 rpm, 10 menit, 4
C dengan High Speed
Refrigerated Centrifuge Type 6500 Kubota, Japan. Ekstrak kasar amilase dan pululanase berada
dalam supernatan, sementara biomassa sel BAL akan terendap
menjadi pellet. Supernatan tersebut selanjutnya digunakan dalam analisis aktivitas enzim amilase poin 3.7.1 Moradi et al. 2014 dan pululanase poin
3.7.2 Asha et al. 2013.
3.4.2. Penentuan jenis starter BAL dan waktu fermentasi talas dengan isolat BAL terpilih
Talas bogor diiris tipis dengan ketebalan 5 mm, selanjutnya irisan talas direndam dalam larutan 1 NaCl Merck, Germany rasio 3:4 selama 1 jam untuk
menghilangkan kandungan kristal oksalat. Setelah proses perendaman, irisan talas
dipisahkan, ditiriskan lalu dicuci beberapa kali dengan akuades steril. Untuk memastikan bahwa fermentasi talas berlangsung secara terkendali telah dilakukan
pra perlakuan dengan merendam irisan talas dalam larutan ethanol 80 selama 30 menit. Selanjutnya irisan talas dicuci dengan akuades steril dan dikeringkan
sehingga mencegah terjadinya fermentasi spontan. Hasil enumerasi pada media NA maupun MRSA menunjukkan bahwa tidak ada mikroba yang tumbuh pada irisan
talas setelah pra perlakuan tersebut, sehingga irisan talas siap diberi perlakuan fermentasi terkendali dengan kultur BAL.
Prosedur penentuan jenis kultur tunggal maupun campuran BAL dan waktu fermentasi talas terbaik dilakukan sebagai berikut. Sebanyak 20 g irisan talas
difermentasi dalam 200 ml akuades steril yang telah diinokulasi dengan kultur tunggal Leu. mesenteroides SU-LS 67, kultur tunggal L. plantarum D-240 dan
kultur campuran Leu. mesenteroides SU-LS 67 dan L. plantarum D-240 1:1, masing-masing sebanyak 2 dengan konsentrasi 10
8
cfuml. Selanjutnya semua perlakuan sampel talas diinkubasi pada suhu ruang selama 0 jam, 6 jam, 12 jam, 18
jam dan 24 jam. Pada setiap interval waktu fermentasi, sampel irisan talas diambil sebanyak 1 gram dan dihancurkan dengan blender Philips, Netherlands sampai
terbentuk suspensi dan dianalisis jumlah total koloni BAL poin 3.7.4, nilai pH poin 3.7.5 dan derajat polimerisasi DP poin 3.7.3. Proses fermentasi talas
dihentikan apabila nilai DP telah mencapai kisaran antara 19-29. Rancangan percobaan untuk penentuan waktu fermentasi terbaik irisan talas oleh kultur tunggal
maupun kultur campuran L. plantarum D-240 dan Leu. mesenteroides SU-LS 67 rasio 1:1 adalah rancangan acak lengkap RAL dengan lama fermentasi 0, 6, 12,
18 dan 24 jam sebagai variable dan nilai rata-rata DP sebagai respons. Pengolahan data dilakukan dengan Analisis ragam ANOVA menggunakan perangkat lunak
SPSS 17.0. Jika berbeda signifikan maka dilanjutkan dengan Uji Beda Nyata
Terkecil BNT pada level λ5 α = 0.05. 3.5. Tahap 2: Fermentasi BAL dan Siklus Pemanasan Bertekanan-Pendinginan
untuk Pembuatan TTM
3.5.1. Perlakuan fermentasi dan pemanasan bertekanan-pendinginan
