dipisahkan, ditiriskan lalu dicuci beberapa kali dengan akuades steril. Untuk memastikan bahwa fermentasi talas berlangsung secara terkendali telah dilakukan
pra perlakuan dengan merendam irisan talas dalam larutan ethanol 80 selama 30 menit. Selanjutnya irisan talas dicuci dengan akuades steril dan dikeringkan
sehingga mencegah terjadinya fermentasi spontan. Hasil enumerasi pada media NA maupun MRSA menunjukkan bahwa tidak ada mikroba yang tumbuh pada irisan
talas setelah pra perlakuan tersebut, sehingga irisan talas siap diberi perlakuan fermentasi terkendali dengan kultur BAL.
Prosedur penentuan jenis kultur tunggal maupun campuran BAL dan waktu fermentasi talas terbaik dilakukan sebagai berikut. Sebanyak 20 g irisan talas
difermentasi dalam 200 ml akuades steril yang telah diinokulasi dengan kultur tunggal Leu. mesenteroides SU-LS 67, kultur tunggal L. plantarum D-240 dan
kultur campuran Leu. mesenteroides SU-LS 67 dan L. plantarum D-240 1:1, masing-masing sebanyak 2 dengan konsentrasi 10
8
cfuml. Selanjutnya semua perlakuan sampel talas diinkubasi pada suhu ruang selama 0 jam, 6 jam, 12 jam, 18
jam dan 24 jam. Pada setiap interval waktu fermentasi, sampel irisan talas diambil sebanyak 1 gram dan dihancurkan dengan blender Philips, Netherlands sampai
terbentuk suspensi dan dianalisis jumlah total koloni BAL poin 3.7.4, nilai pH poin 3.7.5 dan derajat polimerisasi DP poin 3.7.3. Proses fermentasi talas
dihentikan apabila nilai DP telah mencapai kisaran antara 19-29. Rancangan percobaan untuk penentuan waktu fermentasi terbaik irisan talas oleh kultur tunggal
maupun kultur campuran L. plantarum D-240 dan Leu. mesenteroides SU-LS 67 rasio 1:1 adalah rancangan acak lengkap RAL dengan lama fermentasi 0, 6, 12,
18 dan 24 jam sebagai variable dan nilai rata-rata DP sebagai respons. Pengolahan data dilakukan dengan Analisis ragam ANOVA menggunakan perangkat lunak
SPSS 17.0. Jika berbeda signifikan maka dilanjutkan dengan Uji Beda Nyata
Terkecil BNT pada level λ5 α = 0.05. 3.5. Tahap 2: Fermentasi BAL dan Siklus Pemanasan Bertekanan-Pendinginan
untuk Pembuatan TTM
3.5.1. Perlakuan fermentasi dan pemanasan bertekanan-pendinginan
Irisan talas yang sudah dipersiapkan sebelumnya, selanjutnya diberi perlakuan sebagai berikut. Perlakuan fermentasi dilakukan pada irisan talas dengan
menginokulasikan kultur campuran BAL Leu. mesenteroides SU-LS 67: L. plantarum D-240 rasio 1:1, 10
8
cfumL, 2 vv pada suhu 37 C selama 18 jam.
Sementara itu pada perlakuan pemanasan bertekanan-pendinginan, irisan talas diotoklaf 121
C, 15 menit, dengan rasio irisan talas:akuades yaitu 1:2 yang dilanjutkan dengan pendinginan pada refrigerator 4
C, 24 jam. Selanjutnya irisan talas yang telah diberi kedua perlakuan tersebut dikeringkan 70
C, 16 jam dengan oven sampai diperoleh kadar air 12 , lalu ditepungkan dengan pin disk mill dan
diayak sehingga diperoleh sampel tepung talas berukuran 80 mesh. Untuk mengetahui pengaruh perlakuan fermentasi BAL dan jumlah siklus pemanasan
bertekanan-pendinginan autoclaving-coolingOC maka dilakukan pengelompokan tepung talas. Kelompok A perlakuan tanpa fermentasi yaitu: 1 Kode K kontrol,
tanpa OC, 2 Kode OC-1S tanpa fermentasi, 1 siklus OC, 3 Kode OC-2S tanpa fermentasi, 2 siklus OC. Kelompok B dengan fermentasi yaitu: 1 Kode F
fermentasi, tanpa OC, 2 Kode FOC-1S fermentasi, dengan 1 siklus OC, 3 Kode FOC-2S fermentasi, dengan 2 siklus OC. Dokumentasi prosedur pembuatan TTM
dapat dilihat pada Lampiran 1. Sementara itu dokumentasi karakteristik fisik dari keenam sampel TTM dapat dilihat pada Lampiran 2.
3.5.2. Analisis kimia terhadap TTM
Keenam sampel tepung talas dari 2 kelompok perlakuan tersebut dilakukan analisis proksimat, kandungan total pati Dubois et al. 1956, kadar gula pereduksi
Miller 1959, kadar amilosa IRRI 1978, kadar pati resisten Goni et al. 1996, kadar serat pangan total AOAC 1998 dan daya cerna secara in-vitro Anderson et
al. 2002 sebanyak tiga kali ulangan triplo. Tepung talas termodifikasi dengan kandungan RS tertinggi dan daya cerna pati talas terendah dipilih untuk dievaluasi
sifat prebiotiknya. Rekapitulasi perhitungan analisis sifat kimia TTM dapat dilihat selengkapnya di Lampiran 9.
3.6. Tahap 3: Evaluasi Sifat Prebiotik TTM 3.6.1. Isolasi RS dari TTM
Goni et al., 1996
Isolasi pati resisten dari TTM dilakukan dengan menggunakan metode Goni et al. 1996 yang dikombinasi dengan metode gravimetri AOAC 2010. Tepung talas
modifikasi sebanyak 1 g ditempatkan dalam tabung sentrifus. Sampel dicuci dengan menggunakan 8 ml etanol 80 selanjutnya disentrifus pada 554 × g selama 10
menit dan diulang dua kali. Residu ditambah dengan 20 mL buffer sodium asetat 0,1 M pH 5,2, selanjutnya dididihkan dalam penangas air selama 30 menit.
Sebanyak 100 mg sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, lalu ditambahkan 5 mL larutan bufer KCl-HCl pH 1,5 dan 0,1 mL pepsin 4000 U10 mL bufer KCl-
HCl. Setelah diaduk dengan menggunakan vorteks, sampel diinkubasi pada suhu 40
C selama 60 menit pada penangas bergoyang. Sampel kemudian didinginkan pada suhu ruang. Sebanyak 4,5 mL larutan bufer fosfat pH 6,9 dan 0,5 mL larutan
porcine α- amilase 15,2 mg α-amilase per mL bufer fosfat serta 40 l enzim amiloglukosidase AMG ditambahkan ke dalam sampel. Sampel kemudian diaduk
dengan vorteks dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 16 jam sambil terus
digoyang. Setelah itu sampel disentrifus 15 menit, 3000 g, bagian residu diambil dan dicuci dengan 10 mL akuades. Proses sentrifugasi diulang lagi dengan cara yang
sama seperti di atas sehingga diperoleh isolat pati resisten RS.
3.6.2. Ketahanan RS TTM terhadap cairan lambung secara in vitro Nurhayati
et al. 2014
Pati resisten dari TTM diuji ketahanannya terhadap cairan simulasi lambung manusia. Sampel dipersiapkan dengan melarutkan pati resisten dari tepung talas ke
dalam akuades steril 1 bv. Simulasi cairan asam lambung merupakan buffer asam hidroklorida yang tiap gramliter mengandung: NaCl 8gL; KCl 0,2 gL;
Na
2
HPO
4
.2H
2
O 8,25 gL; NaH
2
PO4 14,35 gL; CaCl
2
.2H
2
O 0,1 gL; MgCl
2
.6H
2
O 0,18 gL. Buffer asam klorida ditera pada pH 1, 2, 3, 4 dan 5 dengan menggunakan 5 M HCl. Sebanyak 5 ml buffer HCl pada tiap perlakuan pH
ditambahkan ke dalam 5 ml larutan sampel, selanjutnya diinkubasi dalam water bath pada suhu 37 ± 1
C selama 6 jam. Sebanyak 1 ml sampel diambil secara periodik
