Waktu dan Tempat Penelitian Induksi Streptotozin Pada Tikus Wu Huan 2008 Pembuatan Ransum AOAC 1995

III METODOLOGI

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan mulai bulan Juli 2010 sampai September 2011 dilaksanakan di tiga tempat yaitu 1 Laboratorium Pengolahan, Kimia, serta Biokimia Pangan dan Gizi, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB; 2 Laboratorium Pengolahan, Kimia Pangan, dan Hewan Coba, Puslitbang Gizi dan Makanan, 3 Laboratorium Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2. Bahan dan Alat 3.2.1. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan baku dan bahan kimia. Bahan baku yang digunakan dalam pembuatan pati tapioka termodifikasi polifenol adalah tapiokapati singkong Manihot utilisima, teh hijau Camellia sinensis jenis peko super dan daun jambu biji Psidium guajava merah muda sebagai sumber polifenol. Pati tapioka diperoleh dari pabrik tapioka di Ciluer-Bogor. Teh hijau kering jenis peko super varietas gambung diambil dari Kebun Percobaan Pasir Sarongge Cianjur dan daun jambu biji diambil dari daerah Cilebut-Bogor. Daun jambu biji merah yang diambil adalah bagian pucuk dan dua helai daun muda di bawahnya. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis proksimat, total polifenol, serat pangan, dan daya cerna pati meliputi akuades, K 2 SO 4 , HgO, H 2 SO 4 pekat, H 3 BO 3 , NaOH-Na 2 S 2 O 3 , HCl 0.02N, kertas saring Whatman no.42, kapas, heksana, etanol 95, NaOH 1N, reagen Foline Ciocalteu, Natrium karbonat, standar asam galat, Tikus yang digunakan untuk uji in vivo adalah tikus Sprague dawley jantan sebanyak 36 ekor, umur sekitar 2 bulan berat badan 175-250 g yang diperoleh dari Puslitbang Biomedis, BALITBANG DEPKES RI. Bahan kimia yang digunakan untuk menginduksi tikus menjadi diabetes adalah streptozotocin. enzim termamil, pepsin dan pankreatin, enzim protease, HCl, enzim amiloglukosidase, DNS asam dinitrosalsilat, etanol, aseton, petroleum eter, dan buffer natrium fosfat. Bahan-bahan yang digunakan untuk ransum tikus meliputi ransum standar, ransum perlakuan, kasein, minyak jagung, vitamin, mineral mix, selulosa, dan pati tapioka. Untuk pengukuran glukosa darah tikus diperlukan darah tikus, sedangkan untuk aktivitas enzim Superoksida Dismutase SOD dan kadar malonaldehid MDA diperlukan organ hati, larutan PBS Phosphat Buffer Saline, HCl, larutan TEP tetraetoksipropana, buffer Natrium-bikarbonat, xantin oksidase, dan buffer kalium fosfat. Bahan yang digunakan dalam mengukur profil lipid meliputi serum darah tikus, kit pereaksi kolesterol AMS Diagnostics, kit pereaksi trigliserida AMS Diagnostics, dan kit pereaksi HDL Daichii Pure Chemical. Untuk analisis histologi pankreas, bahan yang diperlukan adalah larutan NaCl fisiologis 0.9, larutan buffer formalin 10, alkohol 70, 80, 90, 95, alkohol absolut, xylol, aquades, paraplast, pewarna Hematoxylin-Eosin, bahan perekat preparat, NaHPO.12H 2 O, NaHPO.2H 2

3.2.2. Alat

O, NaCl, NaOH, HCl, timerosal, deionized water, antibodi monoklonal insulin Sigma 12018, kit pereaksi immunohistokimia dan es batu. Alat yang digunakan untuk analisis kimia diantaranya erlenmeyer, labu takar, gelas piala, labu lemak, kertas saring, desikator, timbangan analitik, penangas air bergoyang, pipet, vortex, cawan porselen dan tutupnya, cawan pengabuan dan tutupnya, desikator, penjepit cawan, oven, tanur pengabuan, Soxhlet dengan kondensor, labu Kjeldahl, penangas listrik, dan spektrofotometer. Untuk pemeliharaan tikus diperlukan tempat makan dan minum, kandang, dan peralatan membuat ransum. Alat untuk analisis aktivitas enzim antioksidan, lipid darah, dan histologi meliputi tabung sentrifus, sentrifus, wadah plastik, pengaduk, mortar, glukometer dan stripnya, tabung ependorf tertutup, mikropipet, termos es, refrigerator, gunting, pisau, silet, botol bertutup, automatic tissue processor, tissue embedding console, penangas, mikrotom, plate panas, staining jar, corong gelas, stopwatch, magnetik stirer, mikrotip, label, keranjang preparat, gelas objek, gelas penutup, mikroskop dan kamera digital mikroskop serta software digital image J .

3.3. Tahapan Penelitian

Penelitian dibagi menjadi 4 tahap Tabel 4. Tahap pertama adalah ekstraksi teh hijau dan daun jambu biji, tahap kedua adalah pembuatan pati tapioka termodifikasi polifenol dan uji daya cerna secara in vitro, tahap ketiga uji in vivo pengaruh tapioka termodifikasi polifenol terhadap profil lipid darah tikus dan terhadap aktivitas antioksidan hati tikus, serta tahap keempat adalah uji in vivo aktivitas hipoglikemik dan histologi pankreas tikus diabetes yang diberi tapioka termodifikasi polifenol. Tabel 4. Tahap penelitian dan analisis Tahap Tujuan penelitian Tahapan Analisis Hasil analisis 1 Menghasilkan ekstrak teh hijau, ekstrak daun jambu biji Pembuatan ekstrak teh hijau, ekstrak daun jambu biji dan analisis sifat kimianya Total fenol dan aktivitas antioksidan ekstrak teh hijau dan daun jambu biji. Total fenol dan aktivitas antioksidan ekstrak teh hijau dan daun jambu biji. 2 Menghasilkan tapioka termodifikasi polifenol dengan daya cerna rendah. Pembuatan tapioka termodifikasi polifenol dan analisis daya cernanya. Proksimat, serat pangan, dan daya cerna pati modifikasi. Data proksimat kadar air, abu, protein, lemak dan karbohidrat, serat pangan, dan daya cerna pati. 3. Menguji pengaruh tapioka termodifikasi polifenol terhadap profil lipid darah TG, HDL, LDL, kolesterol tikus diabetes dan aktivitas antioksidan hati tikus. • Persiapan tikus, induksi streptozotocin. • Pengamatan berat badan BB dan konsumsi ransum tikus. • Analisis serum darah dan hati hati tikus • Pengamatan berat badan tikus setiap 2 hari sekali dan jumlah ransum yang dikonsumsi setiap hari • Analisis profil lipid darah dan antioksidan hati Rata-rata kenaikanpenurunan berat badan tikus Rata-rata ransum yang dikonsumsi tiap kelompok perlakuan Kadar kolesterol TG, HDL, LDL, aktivitas enzim SOD dan kadar MDA 4 Menguji aktivitas hipoglikemik dan mendapatkan gambaran histologi pankreas tikus diabetes yang diberi tapioka termodifikasi polifenol. Analisis serum darah tikus dan analisis histologi jaringan pankreas. • Analisis glukosa darah 2 hari sekali. • Analisis histologi jaringan pankreas • Rata-rata kenaikan penurunan glukosa darah tikus. • Luas pulau Langerhans dan kepadatan sel beta pankreas per 5 bidang pandang.

3.3.1. Penelitian Tahap 1: Ekstraksi Teh Hijau dan Daun Jambu Biji

3.3.1.1. Ekstraksi Teh Hijau dan Daun Jambu Biji Tahap ini diawali dengan pembuatan bubuk dan ekstrak teh hijau kering dan daun muda jambu biji merah kering, masing-masing dilakukan menggunakan metode Widowati 2007 dan Nantitanon et al. 2010 yang dimodifikasi Gambar 3. Setelah itu dilanjutkan dengan ekstraksi teh hijau dan daun jambu biji, masing- masing dilakukan dengan kondisi ekstraksi optimum hasil penelitian Widowati 2007 dan metode Nantitanon et al. 2010. Gambar 4.

3.3.1.2. Analisis Kadar Total Fenol Metode Folin-Ciocalteu Sato et al. 1996,

diacu dalam Nantitanon et al. 2010 yang dimodifikasi Total fenol diukur berdasarkan kemampuan reagen Folin-Ciocalteu campuran fosfomolibdat dan fosfotungstat dalam mereduksi gugus hidroksi dari fenol. Inti aromatis pada senyawa fenol gugus hidroksi fenolik dapat mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat menjadi molibdenum yang berwarna biru. Kandungan fenolik total dalam tumbuhan dinyatakan dalam GAE Gallic Acid Equivalent yaitu jumlah kesetaraan miligram asam galat dalam 1 gram sampel. Ekstrak pekat sampel dilarutkan dalam etanol absolut hingga diperoleh konsentrasi akhir 0.2 mgmL. Sebanyak 20 µL larutan ekstrak dalam etanol dicampurkan dengan 45 µL reagen Folin-Ciocalteu dan didiamkan 3 menit. Sebanyak 135 µL Na 2 CO 3 Kadar total polifenol mg GAE100 mg ekstrak = 2 g100 mL ditambahkan ke dalam campuran, divorteks dan disimpan di tempat gelap pada suhu ruang, 2 jam dan divorteks. Absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer pada 750 nm. Asam galat digunakan sebagai standar sehingga satuannya dinyatakan dalam mg GAE100 mg ekstrak. Kurva standar dibuat menggunakan asam galat 0-130 µgml. Kadar total polifenol dihitung berdasarkan persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar. Absorbansi yang diperoleh diplotkan pada kurva standar. Kadar total polifenol dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut: Keterangan: A = absorbansi sampel pada panjang gelombang 750 nm S = slope kemiringan pada kurva standar Fp = faktor pengenceran W = berat sampel mg A x Fp S x W Gambar 3. Proses pembuatan bubuk teh hijau Widowati 2007 dan daun jambu biji merah muda kering Nantitanon 2010 yang dimodifikasi. Gambar 4. Proses ekstraksi bubuk teh hijau Widowati 2007 dan daun jambu biji merah kering Nantitanon 2010. Bubuk daun jambu biji merah muda kering Daun jambu biji merah muda segar diblansir air mendidih, 30 detik direndam air es, 15 menit ditiriskan Dikeringkan 20 jam, 50 o C Teh hijau kering Penggilingan dengan dish mill Pengayakan 32 mesh Bubuk teh hijau kering Ekstrak teh hijau Bubuk teh hijau kering ditambah air 1:10 bv diekstrak dalam waterbath goyang pada 85 o C, 8 menit disentrifus 2000 rpm Disaring vakum dg saringan 200 mesh Ekstrak daun jambu biji merah Bubuk daun jambu biji merah kering ditambah air mendidih 1:6 bv Diekstrak 3kali dalam ultrasonicbath, 10 menit pada suhu ruang dipekatkan dengan rotavapor 58–62 o Brix, 80 o C

3.3.1.3. Aktivitas Antioksidan, Metode DPPH Kubo et al. 2002 yang

dimodifikasi Untuk mengukur aktivitas antioksidan adalah dengan mereaksikan sampel dengan radikal bebas DPPH, buffer asetat dan etanol dalam methanol sehingga terbentuk warna ungu. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil. Tingginya aktivitas antioksidan pada sampel akan ditunjukkan oleh banyaknya DPPH yang direduksi yang terlihat dengan semakin pudarnya warna ungu. Warna yang terbentuk dibaca dengan spektrofotometer pada 517 nm. Trolox digunakan sebagai standar yang merupakan analog vitamin E yang larut dalam air. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam satuan TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity. Analisis dilakukan dengan memasukkan 1 ml buffer asetat 100 mM pH 5.5, 1.87 ml etanol dan 0.1 ml radikal bebas DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl 3 mM dalam metanol ke dalam tabung reaksi. Kemudian sebanyak 0.03 ml larutan sampel ditambahkan ke dalam tabung tersebut, divorteks dan diinkubasi pada 25 o Sebagai kontrol digunakan 0.03 ml aquades sebagai pengganti sampel. Kemudian absorbansinya diukur pada 517 nm. Standar digunakan adalah Trolox C, selama 20 menit. ® 6-Hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid 0; 1.25; 2.5 dan 5 mM sehingga satuannya dinyatakan dalam TEAC. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan. 3.3.2. Penelitian Tahap 2: Pembuatan Pati Tapioka Termodifikasi Polifenol. 3.3.2.1. Pembuatan Pati Tapioka Termodifikasi Polifenol Setelah diperoleh ekstrak teh hijau dan ekstrak daun jambu biji merah, dilanjutkan dengan pembuatan pati tapioka termodifikasi. Alur pembuatan tapioka termodifikasi polifenol dapat dilihat pada Gambar 5. Untuk mendapatkan pati tapioka termodifikasi polifenol, tapioka direndam selama 6 jam dalam larutan ekstrak teh hijau dan ekstrak daun jambu biji 58- 62°Brix.. Setelah direndam pati ditiriskan dan dikeringkan dalam oven 80 o C, 4 jam hingga kadar air maksimal 13. Evaluasi sifat kimia dilakukan untuk tapioka termodifikasi ekstrak polifenol teh hijau dan daun jambu biji dengan konsentrasi masing-masing 4, 6, dan 8 6 sampel. Sifat kimia yang dianalisis meliputi serat pangan, dan daya cerna. Berdasarkan evaluasi sifat kimia akan ditentukan 2 pati tapioka termodifikasi polifenol yang memiliki daya cerna terendah untuk digunakan pada penelitian tahap 2. Gambar 5. Pembuatan pati tapioka termodifikasi untuk uji hipoglikemik dan analisis kimianya

3.3.2.2. Analisis Proksimat AOAC 1995

Pengujian analisis proksimat terdiri dari analisis kadar air, abu, protein, lemak, sedangkan karbohidrat diperoleh dengan cara “by difference”. Analisis kadar air dilakukan dengan menggunakan metode oven, analisis kadar abu dengan pengabuan kering, analisis kadar lemak dengan metode Soxhlet, dan analisis kadar protein dilakukan dengan metode Mikro-Kjeldahl. Digoyang selama 6 jam, 200 rpm, T ruang Ditiriskan Dikeringkan dalam pengering oven T 80 o C , ±4 jam sampai kadar air maks 13 2 pati tapioka termodifikasi terpilih Serat pangan dan daya cerna Pati Tapioka Ditambah ekstrak cair teh hijau 58-62°Brix 0, 4, 6, dan 8 Tapioka:larutan = 1 : 1 Ditambah ekstrak cair daun jambu biji 58-62°Brix 0, 4, 6, dan 8 Tapioka:larutan = 1 : 1 Pati tapioka termodifikasi ekstrak daun jambu biji 0, 4, 6, dan 8 Pati tapioka termodifikasi ekstrak daun teh hijau 0, 4, 6, dan 8

3.3.2.3. Analisis Kadar Serat Pangan Metode Enzimatis AOAC 1995

Analisis kadar serat pangan dilakukan dengan mereaksikan sampel dengan enzim termamil, pepsin dan pankreatin. Residu yang merupakan serat pangan yang tidak larut dicuci dengan etanol dan aseton, kemudian dikeringkan. Filtrat yang merupakan serat larut diendapkan dengan etanol, kemudian disaring dan dikeringkan. Pengukuran serat pangan dibagi menjadi tiga tahap yaitu persiapan sampel, pengukuran serat pangan tidak larut, dan pengukuran serat pangan larut . Persiapan Sampel Sampel yang telah diekstrak lemaknya dengan pelarut petroleum eter pada suhu kamar selama 15 menit ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian ditambahkan 25 ml buffer natrium fosfat 0.1 M pH 6. Penambahan buffer dimaksudkan untuk menstabilkan ezim termamil. Sampel ditambahkan 100 µl termamil lalu dipanaskan sambil ditutup dan diinkubasi T=10 o Sampel didinginkan, kemudian ditambahkan 20 ml akuades dan ditambahkan HCl 4 M hingga pH 1.5. Sampel ditambahkan 100 mg pepsin, lalu erlenmeyer ditutup dan diinkubasikan pada 40 C, selama 15 menit sambil sesekali diaduk. Tujuan penambahan enzim termamil dan pemanasan ialah untuk memecahkan pati dengan menggelatinisasikan terlebih dahulu. o C sambil diaduk selama 60 menit. Pengaturan pH hingga 1.5 dimaksudkan untuk mengkondisikan agar aktivitas enzim pepsin maksimum. Sampel ditambahkan 20 ml akuades dan diatur pH-nya hingga 6.8 dengan cara ditambahkan NaOH. Sampel ditambahkan 100 ml enzim pankreatin, lalu erlenmeyer ditutup dan diinkubasi pada 40 o Pengukuran Residu Serat Makanan Tidak Larut C selama 60 menit sambil diaduk, kemudian sampel ditambahkan HCl kembali hingga pH 4.5. Selanjutnya sampel disaring sehingga diperoleh endapan yang dicuci dengan menggunakan 10 ml akuades sebanyak 2 kali. Residu dari hasil persiapan sampel dicuci dengan 10 ml etanol 95 dan 10 ml aseton masing-masing sebanyak 2 kali, lalu dikeringkan pada 105 o C sampai berat tetap sekitar 12 jam dan dimasukkan dalam desikator kemudian ditimbang D1. Suspensi yang telah kering diabukan dalam tanur 500 o Filtrat Serat Makanan Larut C selama 5 jam, didinginkan dalam desikator dan ditimbang I1. Volume dari filtrat yang diperoleh dari persiapan sampel ditambahkan akuades sampai dengan 100 ml, ditambah 400 ml etanol 95 hangat 60 o C, dan diendapkan selama 1 jam. Filtrat disaring, kemudian dicuci dengan 10 ml etanol 95 dan 10 ml aseton sebanyak 2 kali. Sampel dikeringkan pada 105 o C selama 24 jam, kemudian dimasukkan ke dalam desikator dan ditimbang D2. Sampel yang telah kering diabukan dengan suhu 500 o Penetapan Blanko C selama 5 jam, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang I2. Analisis ini menggunakan blanko yang diperoleh dengan cara yang sama tetapi tanpa adanya sampel hanya akuades. Nilai blanko harus diperiksa ulang terutama jika menggunakan enzim dari kemasan yang baru. Total Serat Makanan Total serat makanan diperoleh dengan menggunakan serat makanan larut dan tidak larut. Perhitungan: D1 - I1 - B1 Serat makanan tidak larut bk = 100 W x D2 - I2 - B2 Serat makanan larut bk = 100 W x Nilai TDF bk = Nilai IDF + SDF Keterangan: Angka 1 menunjukkan berat sampel pada analisis serat makanan tidak larut dan 2 menunjukkan berat sampel pada analisis serat makanan larut. W = berat sampel g D = berat setelah analisis dan dikeringkan g I = berat setelah diabukan g B = berat blanko bebas serat g

3.3.2.4. Analisis Daya Cerna Pati Secara Enzimatis Muchtadi Palupi

1992 Analisis daya cerna pati dilakukan dengan mereaksikan sampel yang mengandung 1 g pati dengan enzim α-amilase. Pati dihidrolisis oleh enzim α- amilase menjadi maltosa. Maltosa diukur jumlahnya menggunakan spektrofotometer setelah direaksikan dengan asam dinitrosalisilat. Daya cerna pati diukur sebagai jumlah maltosa pada sampel dibagi dengan jumlah maltosa dari pati murni standar. Sebanyak 1 g tepung atau pati murni dimasukkan dalam erlenmeyer 250 ml, lalu ditambahkan dengan 100 ml air destilata. Wadah ditutup dengan alumunium foil dan dipanaskan dalam wadah waterbath hingga mencapai 90 o C sambil diaduk. Setelah mencapai 90 o C, sampel segera diangkat dan didinginkan. Dari larutan tersebut dipipet 2 ml ke dalam tabung reaksi tertutup, lalu ditambahkan 3 ml akuades dan 5 ml buffer fosfat 0.1 M pH 7. Masing-masing sampel dibuat dua kali, salah satunya adalah blanko. Tabung ditutup dan diinkubasi pada 37 o Sebanyak 1 ml campuran hasil inkubasi dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup berisi 2 ml DNS asam dinitrosalsilat. Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit, lalu didinginkan dengan air mengalir. Tambahkan 10 ml akuades dan dibuat homogen dengan vorteks, lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm yang ditunjukkan dari warna oranye-merah yang terbentuk dari reaksi campuran tersebut. Kurva standar diperoleh dari perlakuan DNS terhadap 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 ml larutan maltosa murni 0.5 mgml yang ditepatkan menjadi 1 ml dengan akuades. C selama 15 menit. Larutan diangkat dan ditambahkan 5 ml larutan α-amilase 1 mgml dalam buffer fosfat pH 7 untuk sampel dan 5 ml buffer fosfat pH 7 untuk blanko sampel. Inkubasi dilanjutkan selama 15 menit. A - a Daya cerna pati = 100 B - b x Keterangan: A = kadar maltosa sampel a = kadar maltosa blanko sampel B = kadar maltosa pati murni b = kadar maltosa blanko pati murni

3.3.3. Penelitian Tahap 3: Uji In vivo Pati Tapioka Termodifikasi Polifenol

terhadap Profil Lipid Darah Tikus dan terhadap Aktivitas Antioksidan Hati Tikus

3.3.3.1. Persiapan Uji In vivo pada Tikus

Sebelum memasuki tahap ketiga sampai dengan keempat dilakukan tahap persiapan uji in vivo pada tikus. Alur penelitian uji in vivo dapat dilihat pada Gambar 6. Gambar 6. Alur penelitian in vivo pada tikus Tikus yang digunakan adalah tikus jantan putih strain Sprague dawley umur sekitar 2 bulan dengan bobot badan antara 175-200 g sebanyak 36 ekor. Tikus percobaan kemudian dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan, tiap perlakuan terdiri atas 6 ekor tikus. Tahap persiapan tikus percobaan meliputi masa adaptasi selama 2 minggu dengan pemberian ransum standar dan air minum secara ad libitum. Pada masa adaptasi tikus diberi cekok dengan antibiotik Amoxillin dan obat cacing Vermox dengan dosis masing-masing 500 mgkg BB untuk mencegah timbulnya penyakit pada tikus. Setiap ekor tikus menempati satu kandang dan ditempatkan dalam ruangan yang telah diatur siklus udara dan cahaya. Semua tikus diberi ransum secara teratur dan ditempatkan dalam ruangan dengan suhu kamar dan dilengkapi blower untuk menjaga kelembaban lingkungan. Pemberian ransum dilakukan setiap hari antara pukul 07.00 sampai dengan 09.00 WIB. Jumlah Induksi streptotozin 45 mgKgBB Pengamatan: 1. Jumlah pakan yang dikonsumsi per hari per individu per kelompok 2. Berat badan setiap 2 hari sekali 3. Kadar glukosa darah setiap 2 hari sekali selama perlakuan. Kelompok tikus normal NN=Pati tapioka alami NJ=Pati tapioka termodifikasi polifenol 1 NT=Pati tapioka termodifikasi polifenol 2 Kelompok tikus diabetes DN=Pati tapioka alami DJ=Pati tapioka termodifikasi polifenol 1 DT=Pati tapioka termodifikasi polifenol 2 Hari ke 35 terminasi tikus, pengambilan darah, organ hati dan pankreas untuk analisis: 1. Glukosa darah dan profil lipid darah TG, Kolesterol, HDL, LDL 2. Aktivitas antioksidan, MDA, dan enzim SOD 3. Histologi: pulau Langerhans dan sel beta pankreas ransum yang diberikan sebanyak ±20 ghariekor. Banyaknya ransum yang dikonsumsi dihitung setiap hari berdasarkan jumlah ransum yang tersisa. Masa percobaan didahului oleh masa adaptasi selama 2 minggu. Pada masa adaptasi, tikus diberi ransum standar kontrol sebagai makanan dan air sebagai minuman ad libitum. Setelah masa adaptasi, pemberian ransum dilanjutkan dengan ransum uji sesuai dengan kelompok tikus. Dengan masa percobaan selama 35 hari. Masing-masing kelompok tikus diberi perlakuan yang berbeda Tabel 6. Tabel 5. Kelompok perlakuan tikus Kontrol tikus normal Perlakuan tikus diabetes KN=Pati tapioka asli KJ=Pati tapioka termodifikasi polifenol 1 KT=Pati tapioka termodifikasi polifenol 2 DN=Pati tapioka asli DJ=Pati tapioka termodifikasi polifenol 1 DT=Pati tapioka termodifikasi polifenol 2

a. Induksi Streptotozin Pada Tikus Wu Huan 2008

Tikus dibuat menjadi diabetes melalui induksi streptotozin dosis tunggal 45 mgkg BB dengan tahapan sebagai berikut: 1. 2. Sebelum dilakukan induksi dengan streptozotocin STZ, semua tikus dipuasakan selama 6-8 jam dan air tetap diberikan seperti biasa. 3. Larutan buffer natrium sitrat 50 mM pH 4.5 disiapkan dan 1 ml buffer tersebut ditempatkan ke dalam setiap tabung mikrosentrifus 1.5 ml dan tutup tabung dengan aluminium foil. 4. Sebelum injeksi, STZ dilarutkan ke dalam larutan buffer natrium sitrat 50 mM pH 4.5 sampai mencapai konsentrasi akhir 10 mgml. Larutan STZ harus disiapkan segar untuk setiap injeksi dan disuntik dalam waktu 5 menit. 5. Induksi tikus dengan STZ dilakukan secara intraperitoneal dengan menggunakan syringe 3 ml dan jarum 23-G, sebanyak 45 mgkg untuk tiap ekor tikus. Buffer sitrat pH 4.5 disuntikkan dengan volume yang sama secara intraperitoneal untuk kelompok kontrol. Tikus dikembalikan ke kandang dan diberi ransum dan air sukrosa 10 hingga tercapai glukosa darah puasa yang stabil 150 mgdl selama 3 hari berturut-turut.

b. Pembuatan Ransum AOAC 1995

Pembuatan ransum tikus mengikuti metode AOAC 1995. Pemberian ransum dilakukan setiap hari sebanyak 20 gekor. Komposisi ransum didasarkan pada perhitungan sebagai berikut: Vitamin f = 1 Sumber protein yang digunakan adalah kasein dan sebagai sumber lemak adalah minyak jagung. Mineral yang digunakan merupakan mineral mix yang terdiri dari KI 0.79 g, NaCl 139.30 g, KH 2 PO 4 389.00 g, MgSO 4 anhidrat 53.70 g, CaCO 3 381.40 g, FeSO 4 .7H2O 27.00 g, MnSO 4 .2H 2 O 4 .01 g, ZnSO 4 .7H 2 O 0.55 g, CUSO 4 .5H 2 O 0.48 g, dan CoCl 2 .6H 2

c. Pengukuran Jumlah Konsumsi Ransum dan Berat Badan