HDL cholesterol
Cholesterol esterase
Cholesterol + H
2
O H
2 2
O
2
+ 4-aminoantipyrine
Peroksidase
Komponen merah-keunguan + DSBmT
Sebanyak 3.0 µl sampel serum darah dimasukkan ke dalam tabung dan ditambahkan 300 µl larutan reagen lalu divorteks. Sebagai blanko digunakan 1.00
ml reagen. Larutan diinkubasi selama 5 menit 37°C. Absorbansi larutan dibaca pada λ 600 nm.
Prosedur pengujian:
Penghitungan dilakukan melalui rumus: Konsentrasi mgdl = Abs Sampel
Abs Standar x Konsentrasi Standar
d. Pengukuran Kadar LDL Friedewald 1972
Kadar low density lipoprotein LDL dapat dihitung dengan menggunakan rumus Friedewald:
LDL = Kolesterol total – Trigliserida5-HDL
3.3.3.3. Analisis Aktivitas Antioksidan Hati a.
Persiapan Homogenat Hati Singh et al. 2000
Hati sebanyak 1.25 g dicacah dalam kondisi dingin dalam 5 ml larutan PBS yang mengandung 11.5 gL KCl, kemudian disentrifus pada 1074 g 4000
rpm, 10 menit pada kondisi dingin 4°C sehingga diperoleh supernatan jernih homogenat. Homogenat ini digunakan untuk analisis kadar malonaldehid
MDA dan aktivitas enzim antioksidan superoksida dismutase SOD.
b. Pengukuran Aktivitas Enzim Superoksida Dismutase SOD Hati Kubo
et al. 2002; Wijeratne et al. 2005; Prangdimurti 2007
Prinsip dari pengukuran aktivitas enzim SOD adalah mengukur kapasitas menangkap radikal anion superoksida. Anion superoksida dihasilkan secara
enzimatis oleh sistem xantin-xantin oksidase. Enzim SOD berperan mendismutasi superoksida O
2
atau HO
2
radikal hidroperoksil. Dalam prosedur analisis yang dilakukan, radikal superoksida dihasilkan terlebih dahulu dari reaksi antara xantin
dan xantin oksidase. Radikal superoksida selanjutnya akan mengoksidasi garam tetrazolium berwarna kuning menjadi formazan yang berwarna biru.
Prosedur pengujian dilakukan dengan mereaksikan supernatan jernih hati sebanyak 0.06 ml dengan 2.7 ml buffer natrium-bikarbonat 50 mM yang
mengandung 0.1 mM EDTA pH 10, 0.06 ml xantin 10 mM, 0.03 ml BSA Bovine Serum Albumin 0.5, 0.03 ml NBT Nitroblue Tetrazolium, 2.5 mM.
Selanjutnya dilakukan penambahan 0.6 ml xantin oksidase 0.04 unit. Absorbansi diukur dengan spektr
ofotometer pada λ 560 nm dari 0–30 menit dengan interval waktu 5 menit. Absorbansi yang digunakan dalam perhitungan pada 30 menit.
Sebagai kontrol digunakan larutan yang digunakan pada saat preparasi hati PBS + KCl.
Aktivitas SOD dihitung dengan menggunakan persamaan berikut: {1-AB} x 100
Dimana, A = Absorbansi larutan sampel, B = Absorbansi larutan kontrol
c. Pengukuran Kadar Malonaldehid MDA Hati Singh et al 2000
Prinsip pengujian kadar malonaldehid MDA adalah dengan mengukur absoransi warna merah muda yang terbentuk akibat adanya reaksi antara MDA
dengan TBA Thiobarbituric Acid membentuk komplek MDA-TBA. Prekursor
MDA adalah TEP tetraetoksipropana sehingga dapat digunakan sebagai larutan standar pada pengukuran MDA. TEP akan bereaksi dengan TBA membentuk
warna merah muda. Prosedur pengujian kadar MDA adalah dengan mereaksikan 0.5 ml
homogenat hati dengan 2.0 ml HCl dingin 0.25N yang mengandung 15 TCA Trichloroacetic Acid, 0.38 TBA Thiobarbituric Acid
, dan 0.5 BHT Butylated Hydroxytoluene. Campuran dipanaskan 80°C selama 1 jam. Setelah
dingin, campuran disentrifus pada 3500 rpm 822 g selama 10 menit. Supernatan diambil dan diukur absorbansi dengan spektrofotometer pada λ 532 nm. Sebagai
larutan standar digunakan TEP tetraetoksipropana.
3.3.4. Penelitian Tahap 4: Pengujian
In Vivo Pati Tapioka Termodifikasi Polifenol terhadap Glukosa Darah dan Histologi Jaringan Pankreas
Tikus
3.3.4.1. Analisis Kadar Glukosa Darah Wu Huan 2008
Percobaan pada seluruh kelompok dilakukan selama 35 hari dan kadar glukosa darah tikus diamati setiap 2 hari sekali setelah diinduksi streptozotocin.
Sebelum pengukuran kadar glukosa darah, tikus dipuasakan selama 6-8 jam Wu Huan 2008, tetapi tetap diberi air minum. Kadar glukosa darah tikus percobaan
diukur menggunakan glukometer.
3.3.4.2. Analisis Histologi Kiernan 1990
Analisis histologi dilakukan terhadap organ pankreas. Analisa ini meliputi tahapan sampling, trimming, dehidrasi, clearing penjernihan, infiltrasi parafin,
embeddin g pencetakan, sectioning pemotongan, dan pewarnaan hematoksilin
eosin dan imunohistokimia terhadap sel β.
a. Sampling
