paraffin ini dilakukan dalam Automatic Tissue Processor-Sakura®, Japan yang diatur bersuhu ± 60
o
C.
e. Embedding Pencetakan
Proses embedding adalah proses memasukkanmenanam jaringan ke dalam paraffin
cair dalam cetakan sehingga memudahkan pada proses pemotonganpenyayatan dengan mikrotom. Pertama-tama diisi dengan paraffin
cair sampai cembung di atas plate panas pada Embedding Tissue Consol-Sakura®, Japan
. Potongan jaringan yang telah melalui proses infiltrasi paraffin dimasukkan ke dalam cetakan, dan diatur letaknya. Bagian jaringan yang akan dipotong,
dipasang menghadap dasar cetakan. Cetakan embedding selanjutnya dipindahkan ke plate yang dingin agar paraffin membeku. Setelah paraffin membeku, label
jaringan ditempelkan. Setelah paraffin beku sempurna dan dingin, blok paraffin dikeluarkan
dengan mengungkit salah satu pinggiran antara cetakan dengan paraffin. Jaringan yang telah ditanam pada blok paraffin selanjutnya disimpan di lemari es minimal
1 jam, agar dihasilkan pita jaringan yang baik tidak pecah atau terlipat.
f. Sectioning Pemotongan
Sectioning dilakukan pada ruangan yang dingin, sehingga blok paraffin
tetap keras. Pemotongan dilakukan dengan menggunakan mikrotom putar rotary microtom
. Blok paraffin yang telah didinginkan di dalam lemari es diambil dan dipasang pada blok holder. Pemotongan diawali dengan trimming, yaitu
memotong pada ketebalan 10 mikron untuk mempercepat pencapaian bidang potong jaringan. Jika sudah dicapai bidang potongan penuh terhadap seluruh
permukaan jaringan, maka ketebalan diatur pada 4 mikron. Kemudian pemotongan dilakukan kembali hingga dihasilkan sayatan berupa pita pendek,
berisi 4 sampai 5 potongan berangkai. Potongan tersebut diambil dengan kertas yang sudah dibasahi dan diambangkan di atas permukaan akuades hangat 50°C.
Potongan yang baik dilekatkan pada gelas objek berperekat dilapisi ewitt. Selanjutnya dimasukkan ke dalam air hangat sebentar untuk merentangkan
jaringan yang menggulung untuk mengatur posisi jaringan pada gelas objek.
Posisi potongan jaringan ditempatkan pada sepertiga bagian bawah gelas objek, dan beri label. Potongan jaringan kemudian disimpan di dalam inkubator selama 1
malam pada 37°C untuk penyempurnaan penempelan jaringan pada gelas objek dan selanjutnya siap untuk diwarnai.
g. Pewarnaan Imunohistokimia Terhadap Sel β
Tahapan analisis dimulai dari proses deparafinisasi yang bertujuan untuk melarutkan parafin dari jaringan, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial
larutan xylol 3 kali ulangan. Selanjutnya dilakukan rehidrasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan alkohol alkohol absolut 3 kali ulangan, 95,
90, 80, dan 70. Sediaan lalu direndam dalam air bebas ion deionized water
selama 5-10 menit, direndam H
2
O
2
dalam metanol 1:100 selama 15 menit. Sediaan direndam dalam air bebas ion dan PBS, masing-masing selama 2 x
10 menit. Kemudian sediaan diletakkan pada kotak sediaan dan ditetesi serum normal 10 dalam PBS 50-60 µlsediaan, diinkubasi pada 37°C, 30-60 menit.
Sediaan dicuci dengan PBS 3x5 menit, lalu ditetesi antibodi primermonoklonal terhadap insulin Sigma 12018 dalam PBS 1:1000 sebanyak 50-60 µlsediaan.
Inkubasi dalam refrigerator semalam, lalu dicuci dengan PBS 3 x 10 menit. Sediaan kemudian ditetesi dengan antibodi sekunder DAKO envision peroksidase
Code No. K1491 yang telah diencerkan dengan PBS DAKO : PBS = 3 : 1, sebanyak 50-60 µlsediaan, lalu diinkubasi pada ruangan gelap, suhu 37°C, 30-60
menit. Sediaan dicuci dengan PBS 3 x 5 menit, lalu ditetesi DAB diaminobenzidine sebanyak 50-60 µlsediaan dalam tris buffer dan H
2
O
2.
h. Pengamatan dan Pemotretan
Kategori