Uji Triple Sugar Iron

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.3.2. Metode Sangkaan SNI 01-2897-1992

Uji sangkaan dilakukan dengan metode Angka Paling Mungkin APM seri tabung 3-3-3. Prosedurnya yaitu sampel dikocok sebanyak 25 kali kemudian diencerkan dengan menggunakan larutan pengencer yaitu Peptone Water sesuai dengan tingkat pengencerannya. Dipipet sebanyak 1 mL sampel dengan pengenceran 10 -1 pada 3 seri tabung pertama yang berisi Lactose Broth LB sebanyak 5 mL yang telah terdapat tabung durham didalamnya. Untuk 3 seri tabung berikutnya dipipet sebanyak 1 mL sampel dengan pengenceran 10 -2 dan untuk 3 seri tabung selanjutnya dipipet sebanyak 1 mL sampel dengan pengenceran 10 -3 . Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu 36±1ºC selama 24 dan 48 jam lalu dicatat jumlah tabung yang membentuk gas.

2.3.3. Uji Penegesan Confirmed Test SNI 01-2897-1992

Tabung yang positif pada uji sangkaan kemudian dilakukan uji penegasan. Prosedurnya yaitu diambil sebanyak 1 ose biakan dan diinokulasi pada media Brilliant Green Lactose Bile Broth 2 BGLB 2 sebanyak 10 mL yang terdapat pada tabung reaksi yang telah berisi tabung durham. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu 36±1ºC selama 24-48 jam kemudian dihitung jumlah tabung yang menghasilkan gas dan dihitung jumlah bakterimL.

2.3.4. Identifikasi Bakteri Escherichia coli SNI 01-2897-1992

Diambil sebanyak 1 ose dari tabung reaksi yang positif pada uji sangkaan ke dalam tabung rekasi yang berisi Escherichia coli broth dan tabung durham. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu 44-45ºC selama 24-48 jam dan dicatat tabung yang positif. Tabung yang membentuk gas kemudian diinokulasi pada media Eosin Methylene Blue Agar EMBA dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama 18-24 jam. Dipilih koloni berwarna kilap logam yang kemudian diinokulasi pada media agar miring Nutrient Agar NA dan diinkubasi suhu 35°C selama 24 jam.

2.3.4.1. Pewarnaan Gram SNI 01-2897-1992

Prosedur pewarnaan Gram yaitu diambil sebanyak 1 ose biakan bakteri dalam media Nutrient Agar NA pada gelas objek kemudian difiksasi dengan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta cara melewatkan sediaan di atas api bunsen. Sediaan ditetesi beberapa tetes larutan kristal violet dibiarkan selama 1 menit. Setelah itu, dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Sediaan ditetesi beberapa tetes lugol lalu dibiarkan selama 1 menit. Dicuci kembali menggunakan air mengalir dan dikering anginkan. Sediaan dicuci dengan alkohol 96 selama 30 detik. Dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan. Sediaan diberi beberapa tetes safranin lalu biarkan selama 10-30 detik. Dicuci menggunakan air mengalir setelah itu dikering anginkan dan diserap dengan kertas saring kemudian diamati di bawah mikroskop.

2.3.4.2. Uji IMViC SNI 01-2897-1992 dengan modifikasi

a. Uji Indol

Biakan dari media Nutrient Agar NA diinokulasi pada media Sulfide- Indole-Motility SIM dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah diinkubasi, ditambahkan reagen KOVAC sebanyak 0,5 mL lalu didiamkan selama 10 menit. Apabila positif Escherichia coli akan menunjukkan lapisan warna merah pada permukaan biakan.

b. Uji Merah Metil

Biakan dari media Nutrient Agar NA diinokulasi pada Methyl Red-Voges Proskauer MR-VP dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama 48 jam. Setelah diinkubasi, biakan diambil sebanyak 5 mL ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan merah metil sebagai indikator sebanyak 5 tetes dan dikocok. Apabila positif Escherichia coli akan berwarna merah.

c. Uji Voges Proskauer

Biakan dari media Nutrient Agar NA diinokulasi pada pada media Methyl Red-Voges Proskauer MR-VP dan diinkubasi pada suhu 36±1ºC selama 48 jam. Biakan bakteri kemudian diambil sebanyak 1 mL dan ditambahkan 0,6 mL α-Naftol serta 0,2 mL KOH kemudian dikocok dan didiamkan selama 2-4 jam. Apabila positif Escherichia coli akan terbentuk warna kuning coklat. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

d. Uji Sitrat

Biakan dari media Nutrient Agar NA diinokulasi pada media agar miring Simmon Sitrat dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama 48-96 jam. Apabila positif Escherichia coli tidak terjadi perubahan warna pada media.

2.3.4.3. Uji Triple Sugar Iron

Diambil sebanyak 1 ose bakteri dari media Nutrient Agar NA kemudian diinokulasi dalam media Triple Sugar Iron Agar TSIA dengan cara menggores bagian miringnya dan menusuk bagian tegaknya kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 20-48 jam. Apabila positif Escherichia coli terjadi perubahan warna pada media uji yaitu permukaan agar berwarna kuning dan bagian dasar kuning, agar pecah atau terangkat karena produksi gas. Tabel 3.1 Hasil Uji Positif Escherichia coli Uji Hasil positif Escherichia coli Uji Indol Terbentuk lapisan warna merah pada permukaan biakan.