13
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 2.2 Metode APM
1.5.1.1. Uji Sangkaan
Uji sangkaan merupakan tes pandahuluan untuk melihat ada tidaknya kehadiran bakteri Coliform pada suatu sampel berdasarkan terbentuknya asam dan
gas yang disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri kelompok Coliform. Uji ini dilakukan dengan cara menumbuhkan bakteri dalam media Lactose Broth
LB dan diinkubasi selama hingga 48 jam. Hasil positif dan negatif didasarkan pada kekeruhan media dan terbentuk atau tidaknya gelembung pada tabung
durham. Apabila media menjadi keruh dan terbentuk gelembung sebanyak paling tidak 10 dari volume tabung durham maka hasil positif dan sebaliknya apabila
media tetap jernih dan tidak terbentuk gelembung maka hasilnya negatif SNI, 1992; Widyanti dan Ristiati, 2014.
1.5.1.2. Uji Penegasan Confirmed Test
Konfirmasi hasil uji sangkaan perlu dilakukan karena pada uji sangkaan mungkin terdeteksi bakteri non Coliform yang bukan merupakan bakteri indikator
polusi fekal Kiiyukia, 2003. Tabung yang positif terbentuk asam dan gas pada uji sangkaan diinokulasi pada media Brilliant Green Lactose Bile Broth 2
Pengenceran 10
Pengenceran 10
-1
Pengenceran 10
-2
Pengenceran 10
-3
Dilakukan secara 3
replikasi atau 5 replikasi
atau 10 replikasi
Dilakukan secara 3
replikasi atau 5 replikasi
atau 10 replikasi
Dilakukan secara 3
replikasi atau 5 replikasi
atau 10 replikasi
Hasil dari 3 tabung atau 5 tabung atau 10 tabung secara statistik dianalisis tabel APM
14
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
35ºC selama 18-24 jam kemudian lakukan pewarnaan Gram Leboffe dan Pierce, 2011; SNI, 1992.
Gambar 2.4 Koloni Escherichia coli pada media EMBA berwarna
kilap logam kehijauan
Sumber: Dokumen pribadi
Pada suasana asam, Eosin Methylene Blue Agar EMBA akan membentuk kompleks yang akan mengendapkan bakteri Coliform dan membentuk
koloni berwarna kehijauan dengan bintik hitam di tengah koloni dan kilap logam. Reaksi ini merupakan karakteristik Escherichia coli Kiiyukia, 2003. Kilap
logam kehijauan ini sebagai indikator bakteri Coliform fekal yang memfermentasi laktosa dan atau sukrosa. Akan tetapi, pada beberapa strain Escherichia coli
menunjukkan koloni berwarna hitam Leboffe dan Pierce, 2011.
1.5.2.1. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram merupakan metode yang dilakukan untuk membedakan spesies bakteri menjadi 2 kelompok besar yaitu bakteri Gram negatif dan Gram
positif. Pewarnaan Gram dilakukan berdasarkan pada sifat fisika kimia dinding selnya.
Prosedur pewarnaan Gram yaitu diambil sebanyak 1 ose biakan bakteri dalam media Nutrient Agar NA pada gelas objek kemudian difiksasi dengan
cara melewatkan sediaan di atas api bunsen. Sediaan ditetesi beberapa larutan kristal violet dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dikering anginkan. Sediaan ditetesi beberapa tetes lugol lalu dibiarkan selama 1
