16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
menit. Dicuci kembali menggunakan air mengalir dan dikering anginkan. Sediaan dicuci dengan alkohol 96 selama 30 detik. Dicuci dengan air mengalir dan
dikering anginkan. Sediaan diberi beberapa tetes safranin lalu biarkan selama 10- 30 detik. Dicuci menggunakan air mengalir setelah itu dikering anginkan dan
diserap dengan kertas saring kemudian diamati di bawah mikroskop SNI, 1992. Kemampuan untuk mencegah penghilangan warna bukan berdasarkan
pada konstruksi dinding sel antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Dinding sel bakteri Gram negatif memiliki kandungan lipid yang lebih banyak
dan memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tipis daripada dinding sel bakteri Gram positif Leboffe dan Pierce, 2010.
Muatan positif kristal violet melewati dinding sel dan membran sel kemudian berikatan dengan komponen di dalam sel yang bermuatan negatif.
Lugol ditambahkan untuk meningkatkan pewarnaan kristal violet dengan membentuk kompleks kristal violet-lugol. Kemudian dilakukan penghilangan
warna dengan menggunakan alkohol. Pada bakteri Gram negatif, alkohol melarutkan lipid yang terdapat pada membran terluar bakteri Gram negatif dan
meluruhkan kompleks kristal violet-lugol dari sel. Sedangkan pada bakteri Gram positif terjadi dehidrasi karena penetesan alkohol dan menyebabkan tertutupnya
porus selama dehidrasi. Kompleks kristal violet-lugol akan terperangkap dalam lapisan peptidoglikan dan tidak terjadi penghapusan warna. Bakteri Gram negatif
akan mengalami penghilangan warna sedangkan bakteri Gram positif tidak. Lalu dilakukan penetesan safranin yang menyebabkan bakteri Gram negatif akan
menunjukkan warna merah sedangkan Gram positif akan berwarna ungu Leboffe dan Pierce, 2010.
1.5.2.2. Uji Lanjutan
Untuk mengetahui lebih jauh mengetahui jenis bakteri dari golongan yang didapat, harus dilakukan uji lanjutan dengan IMViC Indol, Merah metil, Voges
Proskauer, Sitrat dan uji Triple Sugar Iron. Uji ini penting untuk membedakan bakteri dalam kelompok Coliform.
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
a. Uji Indol
Uji indol
dilakukan untuk
membedakan bakteri
dari famili
Enterobacteriaceae berdasarkan kemampuannya mendegradasi asam amino triptofan dan produksi indol. Mikroorganisme uji diinokulasi pada Triptofan Broth
yang mengandung triptofan yang merupakan asam amino esensial. Oleh beberapa bakteri, triptofan akan dioksidasi yang kemudian akan membentuk indol, asam
piruvat, dan ammonia. Indol ini akan dideteksi dengan penambahan reagen KOVAC yang akan membentuk cincin merah Hemraj et al., 2013.
Media yang digunakan selain Triptofan Broth yaitu Sulfide-Indole-Motility SIM dan Motility-Indole-Ornithine MIO. Reagen Ehrlich dapat digunakan
sebagai alternatif
reagen KOVAC.
Reagen ini
juga mengandung
P-dimetilaminobenzaldehid DMAB yang akan bereaksi dengan indol dan mengahasilkan cincin berwarna merah. Reagen Ehrlich ini lebih sensitif daripada
reagen KOVAC akan tetapi mengandung zat toksik atau pelarut yang mudah terbakar. Reagen Ehrlich direkomendasikan untuk mendeteksi kelompok bakteri
yang memproduksi sedikit indol seperti basilus nonfermentative atau anaerob. Sedangkan reagen KOVAC lebih stabil dan tidak mengandung ekstraksi organik
sehingga formulasi KOVAC lebih cocok digunakan oleh mahasiswa peneliti di laboratorium Hemraj et al., 2013.
b. Uji Merah Metil
Uji merah metil dilakukan bertujuan untuk membedakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang dari famili Enterobacteriaceae. Prinsipnya yaitu
mengukur keasaman akhir dari kultur bakteri pada media Methyl Red-Voges Proskauer MR-VP broth yang mengandung glukosa, pepton, dan dapar fosfat.
Pada tahap awal fermentasi glukosa Escherichia coli dan Klabsiella auragens akan menghasilkan asam sehingga menyebabkan perubahan warna indikator
merah metil menjadi orange dan merah tapi ketika diinkubasi lebih lanjut Klabsiella auragens akan memecah asam piruvat dan asam lain yang kemudian
akan merubah warna merah metil menjadi kuning Hemraj et al., 2013.
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
c. Uji Voges Proskauer
Uji Voges Proskauer dilakukan berdasarkan pada pencernaan glukosa menjadi asetilmetilkarbinol. Jika glukosa dipecah akan bereaksi dengan α-Naftol
dan KOH yang kemudian membentuk warna merah. Untuk Escherichia coli hasilnya akan negatif, yaitu terbentuk warna kuning coklat Hemraj et al., 2013.
d. Uji Sitrat
Uji sitrat dilakukan untuk membedakan bakteri enterik berdasarkan kemampuannya untuk memanfaatkan sumber karbon. Pemanfaatan sitrat
bergantung pada enzim sitrat permease. Media yang digunakan dalam uji ini yaitu Simon Sitrat. Media ini mengandung natrium sitrat yang merupakan satu-satunya
sumber karbon dan energi bagi bakteri. Indikator juga diperlukan dalam uji ini, yaitu bromotimol blue. Ketika asam sitrat dimetabolisme dan menghasilkan
karbon dioksida, kombinasi natrium dan air membentuk natrium karbonat yang merupakan produk yang bersifat alkali basa yang kemudian akan mengubah
warna dari hijau menjadi biru. Jika perubahan terjadi maka hasilnya positif. Sedangkan untuk Escherichia coli akan menunjukkan hasil negatif.
e. Uji Triple Sugar Iron
Uji triple sugar iron dilakukan untuk membedakan bakteri dari famili Enterobacteriaceae berdasarkan kemampuannya memfermentasi laktosa, sukrosa,
glukosa, dan produksi H
2
S Raghavan, 2015. Fermentasi laktosa, sukosa, dan glukosa dideteksi dengan perubahan warna pH indikator yaitu merah fenol dari
merah menjadi kuning sedangkan produksi H
2
S dideteksi dari perubahan warna media menjadi hitam.
Prosedurnya yaitu diambil sebanyak 1 ose bakteri dari media Nutrient Agar NA kemudian diinokulasi dalam media Triple Sugar Iron Agar TSIA
lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 18-24 jam untuk melihat fermentasi karbohidrat dan hingga 48 jam untuk melihat produksi H
2
S Leboffe dan Pierce, 2010. Apabila bakteri yang diinokulasi merupakan bakteri yang hanya
memfermentasi glukosa maka akan terbentuk asam yang menurunkan pH dan
