UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.3 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram
Pada identifikasi bakteri, tahap awal yang dilakukan adalah dengan membuat apusan bakteri uji. NaCl fisiologis, diambil 2 loop dengan
menggunakan ose, kemudian ditempatkan di atas object glass. Ose yang telah digunakan untuk mengambil NaCl fisiologis dipijarkan terlebih
dahulu, kemudian didinginkan. Dengan menggunakan ose yang sama, diambil 1 koloni bakteri dari hasil peremajaan bakteri, ditempatkan di atas
NaCl fisiologis yang sudah ada di atas kaca objek. Suspensi diratakan dengan membentuk area apusan. Suspensi dikeringkan pada suhu ruang
untuk beberapa menit. Suspensi dilewatkan di atas api bunsen untuk
fiksasi apusan Damayanti, 2014.
Apusan bakteri yang telah dibuat, ditetesi dengan zat warna I Gentian Violet diteteskan ke atas area apusan, dibiarkan selama 60
detik. Hasil pewarnaan dengan gentian violet, dicuci perlahan dengan menggunakan aquades, kemudian dibiarkan 2 detik. Apusan bakteri
kemudian ditetesi dengan pewarna lugol, lalu didiamkan selama 60 detik.
Hasil pewarnaan dengan lugol dicuci dengan Alkohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak berwarna sekitar 10
– 20 detik. Dilakukan pencucian lagi dengan menggunakan aquades secara perlahan, didiamkan
selama 2 detik. Terakhir, ditetesi dengan zat warna II Safranin, kemudian didiamkan selama 20 detik. Hasil pewarnaan dengan safranin dicuci
perlahan dengan menggunakan aquades, lalu didiamkan kembali selama 2 detik. Dikeringkan di suhu ruang, setelah mengering ditetesi dengan
minyak imersi. Objek damati di atas mikroskop dengan perbesar 100x Damayanti, 2014.
3.4.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Stok bakteri murni yang akan diujikan Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, dan Propionibacterium acne diremajakan
dengan dipindahkan 1 ose kedalam NA agar miring lalu diinkubasi selama 24 jam. Peremajaan bakteri diakukan dengan tujuan untuk memperoleh
stok bakteri yang masih baru, jadi kemungkinan terkontaminasi cukup
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kecil. Bakteri yang telah diremajakan diambil 5 ose, kemudian diinokulasikan ke dalam 50 mL Nutrient Broth, lalu diinkubasi pada suhu
37ºC suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri sambil dilakukan agitasi 120 rpm, tujuan dilakukan agitasi adalah untuk mempercepat bakteri
dalam membelah diri. Pertumbuhan biakan diamati dengan mengukur densitas
optik Optical
Density, OD
dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm, dengan selang waktu 60 menit hingga memasuki fase stasioner Khodijah et al., 2006.
3.4.5 Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Sebanyak 2 ose bakteri uji hasil peremajaan, disuspensikan dalam 2 mL NaCl fisiologis dalam tabung reaksi steril dan dihomogenkan dengan
vortex selama 15 detik, kemudian kekeruhannya dilihat dengan membandingkan kekeruhan standar 0,5 Mc Farland setara dengan 3x10
8
CFUmL Raihana, 2011.
3.4.6 Pelaksanaan Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Limbah Kulit Pisang
Kepok Musa paradisiaca L.
A. Pembuatan Media Uji
Sebanyak 8 gram media Nutrient Agar NA dilarutkan dalam 400 mL aquades steril. Media dipanaskan sampai mendidih. Dilakukan
pengadukan dengan menggunakan magnetic stirer untuk memastikan media tersuspensi sempurna. Setelah media tersuspensi sempurna,
kemudian di autoklaf pada suhu 121° C selama 15 menit, lalu ditunggu sampai suhu hangat 40
⁰C - 45⁰C. Nutrient Agar yang sudah siap, kemudian dituangkan sekitar 8 mL kedalam cawan petri steril dengan
tingkat permukaan horisontal untuk memberikan kedalaman seragam ±0,5cm. Media didiamkan sampai memadat Ngajow,2013.
B. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji
Pada pengujian aktivitas antibakteri ekstrak limbah kulit pisang kepok, konsentrasi yang dibuat merujuk pada penelitian Rizka Hastari
2012. Ekstrak dibuat larutan induk dengan konsentrasi 100.000 ppm.
Kategori