3. Optimasi
clean-up
Clean-up merupakan salah satu proses yang penting untuk mendapatkan ekstrak bersih saat akan dideterminasi meggunakan GC-ECD. Azoxystrobin
memiliki log P
OW
sebesar 2,71 at 20 °C sehingga pada pH 5,03 tidak mengalami disosiasi dan dapat terjerab pada fasa diam C
18
. Sistem yang digunakan dalam clean-up pada penelitian ini adalah sistem reverse-phase SPE. Peneliti memilih
pelarut yang mampu menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan C
18
, dengan ikatan lemah agar dapat terelusi. Senyawa yang lebih polar akan terelusi dengan fasa gerak air . Sehingga terpilihlah aquabidest sebagai
pelarut pertama karena hanya memiliki kelarutan sebesar 6,7 mgL. Analit yang dituju selanjutnya dielusi dengan menggunakan metanol yang akan mengambil
analit yang tertahan pada penjerap karena kelarutan analit didalam metanol kurang lebih 20 gL. Strategi ini bermanfaat jika analit yang dituju berkadar rendah
Gandjar dan Rohman, 2007. Beberapa optimasi clean-up yang dilakukan dalam penelitian ini adalah kapasitas berat SPE, washing dan fraksinasi elusi metanol
untuk mengelusi analit
Tabel XI. Hasil Optimasi Clean-up
Optimasi Hasil
Kapasitas SPE ≥ 50 mg, yang digunakan 400 mg
Pencucian SPE 30 mL metanol dilanjut 10 mL
aquabidest Kelayakan SPE
Dapat digunakan 3x Washing SPE
5 mL aquabidest Elusi SPE
3 mL metanol
a. Kapasitas berat SPE. Jenis berat SPE ada banyak sekali antara lain 30
mg, 50 mg, 60 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 500 mg, 1 g, 2 g, 5 g, 20 g dll. Berat sorben SPE menentukan jumlah maksimum analit untuk dapat tetap tertahan
Anonim
2
.
Gambar 10. Jenis-jenis SPE dan Kapasitasnya Sigma aldrich
Kapasitas SPE ditentukan dengan menimbang berat 1 mL ekstrak. Berat 1 mL sampel per gramnya tidak boleh melebihi 5 dari berat catride SPE. Hasil
perhitungan tiap 1 mL sampel kering sebesar 2,5 mg, oleh karena itu SPE yang boleh digunakan harus lebih dai 50 mg. Peneliti menggunakan SPE C
18
dengan berat 400 mg.
b. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Dalam
penelitian ini SPE C
18
digunakan lebih dari satu kali dan tidak lebih dari tiga kali. Optimasi ini dilakukan dengan menginjekan 15uL standar intermediet B
menggunakan SPE yang sama. Pencucian SPE dilakukan dengan menggunakan 30 mL metanol dan 10 mL aquabidest . SPE masih dapat dikatakan layak
digunakan apabila RSD kurang dari 20 CCPR,2014 yang artinya masih memiliki keterulangan yang baik dan hasil recovery yang diharapkan masih
dalam kisaran 80-120. Adapun data presisi dan recovery dari penggunaan SPE secara berulang sebagai berikut:
Tabel XII. Hasil Preisi dan Akurasi Kelayakan SPE
Massa ng AUC
DCB AUC
azox Ratio
Recovery Kesalahan
0,684 25368,2 51682,4
2,037 110.666
10.666 0,684
16110,5 33144,7 2,057
105.428 5.428
0,684 20158,1 40942,2
2,031 86.878
13.122 Rata-Rata
2,042 100,991
9,739 SD
0,014 RSD
0,672 Dari data diatas menyatakan bahwa SPE masih layak digunakan
sebanyak tiga kali pemakaian dengan tiap kali pencucian menggunakan 30 mL metanol dan dilanjutkan dengan 10 mL aquabidest.
c. Optimasi washing.
Hasil injeksi eluat metanol setelah washing menggunakan 5 MeOH dan 100 aquabidest dipresentasikan pada gambar
berikut:
Gambar 11. Hasil Eluat Metanol Setelah Washing 5 MeOH dan 100 Aquabidest
Eluat metanol setelah washing menggunakan 100 aquabidest menghasilkan luas puncak standar yang lebih besar jika dibandingkan dengan
1000000 2000000
washing 5 Metanol washing 100 UPW
A U
C A
zo x
y st
ro b
in
AUC Azoxystrobin
eluat metanol setelah washing menggunakan 5 metanol. Terbukti pada kromatogram aquabidest hasil wahing yang ditampung, tidak menunjukan
terdeteksinya azoxystrobin yang terikut pada cairan washing.
Gambar 12. Hasil Tampungan Washing Menggunakan 100 Aquabidest
d. Fraksinasi jumlah metanol untuk menarik analit.
Fraksinasi penarikan analit menggunakan metanol dengan konsentrasi adisi 50uL stok A didapatkan
lima fraksi dengan grafik seperti dibawah ini:
Gambar 13. Fraksinasi Elusi Metanol untuk Menarik Analit
500000 1000000
1500000 2000000
Fraksi I Fraksi II
Fraksi III Fraksi IV Fraksi V
A U
C A
zo x
y st
ro b
in
Jumlah Fraksi
Fraksinasi Elusi Metanol
Hasil fraksinasi ke-3 menyatakan bahwa dengan mengelusikan 3 mL metanol sudah cukup untuk menarik analit yang diharapkan yaitu sebesar
99,830.
C. Validasi Metode Analisis
Kategori