pada tabung reaksi. Tabung dimasukkan ke dalam penangas air mendidih selama 30 menit, lalu didinginkan dan diencerkan sampai 50 ml dengan air suling
dan disaring dengan kertas Whatman 42. Selanjutnya dihomogenisasi selama 5 menit dengan ultrasonic dan didiamkan pada suhu ruang sampai dingin.
Sebanyak 25 ml metanol ditambahkan dan ditepatkan sampai volume 50 ml dengan asam asetat 2. Sampel disentrifuse selama 30 menit pada 4000 rpm.
Supernatan dipisahkan untuk disuntikkan ke High Performance Liquid Chromatografi HPLC, dengan kondisi sebagai berikut :
Fase gerak : H
2
O pH 2 Kolom
: C
18
Kecepatan aliran : 0,5 mlmenit
Program : Isokratik
Detektor : UV visible
Panjang gelombang : 280 nm Kadar vitamin B
12
dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Kadar vitamin B
12
= x [standar vitamin B
12
] x x FP
Keterangan: FP = faktor pengencer
3.3.5 Uji fitokimia Harborne 1987
Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya komponen- komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak kasar daging badan, tinta, dan
cangkang sotong. Ekstrak kasar sampel diperoleh dengan mengeringkan sampel di dalam oven selama ± 24 jam pada suhu 40-50
o
C. Sampel sebanyak 25 g yang telah dihancurkan, dimaserasi dengan pelarut kloroform sebanyak 100 ml 1:4
selama 48 jam dan dishaker dengan kecepatan 8 rpm. Hasil maserasi yang berupa larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whatman 42 sehingga didapat
filtrat dan residu. Filtrat yang diperoleh dievaporasi hingga pelarut memisah dengan ekstrak menggunakan rotary vacuum evavorator pada suhu 50
o
C. Proses ekstraksi sampel dapat dilihat pada Gambar 3. Uji fitokimia yang
dilakukan meliputi uji alkaloid, steroidtriterpenoid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, Molisch, Benedict, Biuret dan Ninhidrin.
Gambar 3 Diagram alir proses ekstraksi sampel
1 Uji alkaloid
Sampel sebanyak 0,05 g dilarutkan dalam beberapa tetes H
2
SO
4
2 N, kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff,
pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila terbentuk endapan putih kekuningan dengan pereaksi Meyer, endapan coklat dengan
pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff. Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 HgCl
2
dengan 0,5 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades sampai 100 ml.
Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara mencampurkan 10 ml akuades dengan 2,5 gram iodin dan 2 gram KI, kemudian dilarutkan dan
diencerkan dengan akuades sampai 200 ml. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara menambahkan 0,8 gram bismut subnitrat dengan
10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram KI dalam 20 ml air. Satu volume campuran diencerkan terlebih
dahulu dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air sebelum digunakan. Pereaksi ini berwarna jingga.
Sampel 25 g
Maserasi dengan metanol 100 ml 1:4 selama 48 jam
Penyaringan Residu
Filtrat
Evaporasi
Ekstrak metanol
2 Uji steroidtriterpenoid
Sebanyak 0,05 g sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhrida asetat ditambahkan ke dalam larutan sebanyak 10 tetes, kemudian
ditambahkan H
2
SO
4
pekat 3 tetes. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi
positif.
3 Uji flavonoid
Sebanyak 0,05 g sampel ditambahkan dengan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan
volume yang sama dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya
flavonoid.
4 Uji saponin
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan
adanya saponin.
5 Uji fenol hidrokuinon
Sebanyak 1 gram sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes
larutan FeCl
3
5. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan.
6 Uji molisch
Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi Molish dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya
karbohidrat ditandai terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
7 Uji benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit.
Terbentuknya warna hijau, kuning, atau endapan merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi.
8 Uji biuret
Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan dengan 4 ml pereaksi Biuret. Campuran dikocok dengan seksama. Terbentuknya larutan berwarna ungu
menunjukkan hasil uji positif adanya peptida.
9 Uji ninhidrin
Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan Ninhidrin 0,1. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit.
Terjadinya larutan berwarna biru menunjukkan reaksi positif terhadap adanya asam amino.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik Bahan Baku
