kembali dalam silol-II selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel jaringan ditutup dengan gelas penutup dan direkatkan dengan entellan. Slide histopatologi siap
diamati di bawah mikroskop dan difoto.
Analisa histopatologi berdasarkan pewarnaan HE
Pengamatan mikroskopik meliputi perubahan-perubahan sel yang dibedakan berdasarkan derajat diferensiasi. Derajat diferensiasi dibagi kedalam
tiga kriteria yaitu tingkat kepadatan sel, pleomorfisme inti sel dan tingkat mitosis sel. Untuk menunjukkan gambaran mikroskopik secara keseluruhan maka
digunakan skoring. Berikut ini merupakan keterangan terhadap skor yang diberikan pada histopat hasil pewarnaan HE berdasarkan metode Elston dan
Ellis 1991. Jika skor derajat diferensiasi antara 3-5, maka jaringan termasuk tingkat
1 atau well differentiated diferensiasi baik yang berarti bahwa bentuk sel atau jaringan penyusunnya lebih banyak menyerupai bentuk sel asalnya. Jika skor
diferensiasi sel antara 6-7, maka jaringan termasuk ke dalam tingkat 2 atau moderately differentiated
diferensiasi sedang, yang berarti bahwa bentuk sel atau jaringan yang menyusunnya 75 masih menyerupai sel asalnya dan 25
telah berubah. Jika nilai diferensiasi sel antara 8-9, maka jaringan termasuk tingkat 3 atau poorly differentiated diferensiasi buruk yang berarti bahwa
bentuk sel atau jaringan yang menyusunnya telah berubah seluruhnya sehingga sel asalnya hanya sedikit sekali atau bahkan nyaris tidak ada.
Rincian kriteria penilaian dijelaskan sebagai berikut: a Tingkat kepadatan sel
Skor 1: tingkat kepadatan sel kanker rendah, ruang antar sel terlihat kurang rapat. Mayoritas sel kanker jumlahnya 75
Skor 2: tingkat kepadatan sel kanker sedang, ruang antar sel terlihat rapat sel kanker 10-75
Skor 3: tingkat kepadatan sel kanker tinggi, ruang antar sel terlihat sangat rapat sedikit atau tidak ada sel kanker jumlahnya 10
b Pleomorfisme inti sel Skor 1: inti sel berukuran kecil, dan sel yang seragam, warna inti sel pada
sebagian sel mulai menghitam dan pada sebagian sel yang lain masih berwarna lebih terang;
Skor 2: pleomorfisme bentuk inti sel mulai meningkat dalam ukuran dan keragamannya. Ukuran sitoplasma mulai mengecil, inti sel
berukuran lebih besar dan semakin terlihat jelas pelipatgandaannya di dalam sel, warna inti sel menghitam;
Skor 3: bentuk inti sel beragam dan berukuran sangat besar, ukuran sitoplasma mulai mengecil, inti terlihat jelas pelipatgandaannya di
dalam sel, warna inti sel menghitam; c Tingkat mitosis sel
Tingkat mitosis sel tergantung dari jumlah lapang pandang . Pada penelitian ini menggunakan 5 lapang bidang pandang.
Skor 1: Jika sel yang bermitosis berjumlah 0-5 sel Skor 2: Jika sel yang bermitosis berjumlah 6-10 sel
Skor 3: Jika sel yang bermitosis berjumlah 11 sel
3.3.8. Pengujian Tunel
Pengujian Tunel menggunakan kit komersial untuk medeteksi sel apoptosis pada jaringan histopatologi yang dikembangkan oleh Roche, USA In
Situ Cell Death Detection Kit, POD. Blok parafin jaringan kanker payudara
mencit dipotong setebal ± 4 µm, lalu diletakkan pada slide yang dilapisi poly-L- lysine
. Selanjutnya, dilakukan deparafinisasi dengan cara pemanasan dan perendaman dalam silol serta rehidrasi menggunakan etanol dengan konsentrasi
menurun. Slide dicuci dengan NaCl 0,85 dan PBS masing-masing selama 5 menit.
Disiapkan larutan stok proteinase-K dalam PBS pH 7,4 dengan konsentrasi 40 µgmL. Ke dalam setiap slide ditambahkan larutan proteinase-K
sebanyak 25 µL, kemudian slide diinkubasi pada suhu 37° C selama 15 menit. Setelah diinkubasi, slide dicuci dengan PBS selama 2 menit 2 kali. Untuk kontrol
positif, slide diinkubasi dengan DNAse-I pada suhu ruang selama 10 menit. Selanjutnya, slide dicuci kembali dengan PBS selama 2 menit 2 kali.
Tahap berikutnya, setiap slide diinkubasi dengan peroksidase 50 µL pada suhu ruang selama 10 menit, lalu dicuci dengan PBS selama 2 menit 2 kali. Pada
masing-masing slide ditambahkan 22,5 µL larutan kit Tunel campuran dari 225 µL label solution dan 25 µL larutan enzim, kemudian slide ditutup dengan
coverslip lalu diinkubasi pada 37° C selama 60 menit. Setelah inkubasi selesai,
slide dicuci kembali dengan PBS selama 2 menit 2 kali, lalu dikeringkan dengan kertas tissue.
Selanjutnya, slide ditetesi dengan converter-POD, kemudian ditutup coverslip lalu diinkubasi kembali pada suhu 37° C selama 30 menit. Setelah
inkubasi, slide dicuci PBS selama 2 menit 2 kali. Tahap berikutnya, slide diinkubasi dengan 100 µL larutan substrat DAB selama 15 menit. Untuk proses
counterstaining , ditambahkan methyl green pada setiap slide lalu didiamkan
selama 5 menit. Tahap akhir adalah proses dehidrasi dengan cara perendaman dalam
etanol bertingkat. Setelah kering, slide ditetesi entellan lalu ditutup coverslip dan dilihat di bawah mikroskop. Sel yang mengalami apoptosis akan berwarna coklat
karena menyerap DAB, sedangkan sel yang tidak mengalami apoptosis berwarna hijau. Jumlah sel yang berapoptosis dihitung untuk menentukan
Indeks Apoptosisnya dengan cara sebagai berikut:
Cara menghitung Indeks Apoptosis:
Setiap slide diamati di bawah mikroskop cahaya dengan Lapang Pandang Besar LPB 400x, kemudian diambil foto sebanyak 3 lapang pandang.
Pada setiap lapang pandang dihitung keseluruhan jumlah sel kanker inti sel berwarna hijau dan jumlah sel apoptosis inti sel berwarna coklat. Untuk setiap
perlakuan ada 5 slide. Perhitungan dilakukan secara ’blind” dan diulang dua kali pada waktu yang berbeda.
Nilai Indek Apoptosis IA dihitung dengan cara sebagai berikut:
Indeks apoptosis IA =
Nilai IA pada setiap lapang pandang tersebut dirata-rata untuk setiap slide. Nilai akhir dari setiap kelompok perlakuan merupakan rata-rata nilai IA setiap slide.
3.3.9. Ekstraksi jaringan kanker Yao 2003
Jaringan kanker mencit beku dithawing di dalam buffer homogenisasi dingin yang mengandung buffer RIPA 50 mmll bufer Tris-HCl pH 7,6; 150 mmol
NaCl, 1 Nonidet
®
P40; 0,5 Sodium deoxycholate, protease inhibitor cocktail 1x, 0,1 SDS dan inhibitor protease cocktail IPC Nacalai Tesque No.
