3.3.7. Pembuatan preparat histopatologi dengan pewarnaan HE Panigoro et al. 2007
Proses pembuatan jaringan menjadi preparat histopatologi melalui tahapan sebagai berikut: fiksasi jaringan, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi,
embedding , trimming, sectioning, deparafinisasi, dan dilanjutkan dengan staining
pewarnaan. Fiksasi jaringan dilakukan dengan merendam sampel jaringan kanker ke dalam larutan formalin 10. Proses pembuatan preparat dan
pewarnaan histologi ini disesuaikan dengan metode yang biasa digunakan di Laboratorium Patologi Anatomi, FKUI Jakarta.
Sampel jaringan kanker yang sudah menjadi histopat direndam ke dalam silol-I selama 5-10 menit untuk menghilangkan parafin, kemudian direndam
dalam silol-II kembali untuk membilas selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel mulai direndam dalam alkohol. Pada tahap ini sampel direndam dalam alkohol
yang menurun konsentrasinya secara bertingkat, yaitu: alkohol absolut 100, alkohol 96, kemudian alkohol 70 masing-masing 5 menit. Konsentrasi yang
menurun secara berturut-turut tersebut akan membuat air memasuki sampel jaringan.
Sampel kemudian direndam dalam akuades selama 5 menit dan direndam dalam larutan hematoksilin selama 5-10 menit. Hematoksilin larutan
stok meyer Hematoxylin, Sigma, HHS-32 akan mewarnai inti sel pada sampel jaringan dengan warna biru. Setelah itu, sampel dimasukkan dalam air mengalir
secara tidak langsung selama 5-10 menit untuk membilas. Sampel yang terlalu biru dicelupkan dalam alkohol asam sebanyak 2-3 celupan. Sampel kemudian
dibilas dalam air mengalir kembali selama 5-10 menit. Kemudian sampel dicelup ke dalam larutan Litium karbonat sebanyak 2-3 celupan agar warna biru yang
timbul menjadi lebih jelas. Sampel kembali dibilas dengan air mengalir selama 5- 10 menit.
Tahap pewarnaan selanjutnya adalah pewarnaan dengan pewarna Eosin mengandung 100 ml stok Eosin, 10 ml stok Phloxin B, 780 ml 95 etanol, dan 4
ml asam asetat glacial selama 1-2 menit untuk mewarnai sitosol sel pada sampel jaringan. Setelah tahap ini, sampel memasuki tahap pencelupan alkohol
yang meningkat konsentrasinya secara berturut-turut sebagai kebalikan dari tahap yang sebelumnya, yaitu: alkohol 70, alkohol 96, dan alkohol absolut
100 masing-masing sebanyak 3-4 celupan. Pada akhir tahap pewarnaan, sampel kembali direndam dengan silol-I selama 5-10 menit, kemudian direndam
kembali dalam silol-II selama 5-10 menit. Setelah itu, sampel jaringan ditutup dengan gelas penutup dan direkatkan dengan entellan. Slide histopatologi siap
diamati di bawah mikroskop dan difoto.
Analisa histopatologi berdasarkan pewarnaan HE
Pengamatan mikroskopik meliputi perubahan-perubahan sel yang dibedakan berdasarkan derajat diferensiasi. Derajat diferensiasi dibagi kedalam
tiga kriteria yaitu tingkat kepadatan sel, pleomorfisme inti sel dan tingkat mitosis sel. Untuk menunjukkan gambaran mikroskopik secara keseluruhan maka
digunakan skoring. Berikut ini merupakan keterangan terhadap skor yang diberikan pada histopat hasil pewarnaan HE berdasarkan metode Elston dan
Ellis 1991. Jika skor derajat diferensiasi antara 3-5, maka jaringan termasuk tingkat
1 atau well differentiated diferensiasi baik yang berarti bahwa bentuk sel atau jaringan penyusunnya lebih banyak menyerupai bentuk sel asalnya. Jika skor
diferensiasi sel antara 6-7, maka jaringan termasuk ke dalam tingkat 2 atau moderately differentiated
diferensiasi sedang, yang berarti bahwa bentuk sel atau jaringan yang menyusunnya 75 masih menyerupai sel asalnya dan 25
telah berubah. Jika nilai diferensiasi sel antara 8-9, maka jaringan termasuk tingkat 3 atau poorly differentiated diferensiasi buruk yang berarti bahwa
bentuk sel atau jaringan yang menyusunnya telah berubah seluruhnya sehingga sel asalnya hanya sedikit sekali atau bahkan nyaris tidak ada.
Rincian kriteria penilaian dijelaskan sebagai berikut: a Tingkat kepadatan sel
Skor 1: tingkat kepadatan sel kanker rendah, ruang antar sel terlihat kurang rapat. Mayoritas sel kanker jumlahnya 75
Skor 2: tingkat kepadatan sel kanker sedang, ruang antar sel terlihat rapat sel kanker 10-75
Skor 3: tingkat kepadatan sel kanker tinggi, ruang antar sel terlihat sangat rapat sedikit atau tidak ada sel kanker jumlahnya 10
b Pleomorfisme inti sel Skor 1: inti sel berukuran kecil, dan sel yang seragam, warna inti sel pada
sebagian sel mulai menghitam dan pada sebagian sel yang lain masih berwarna lebih terang;
Skor 2: pleomorfisme bentuk inti sel mulai meningkat dalam ukuran dan keragamannya. Ukuran sitoplasma mulai mengecil, inti sel
berukuran lebih besar dan semakin terlihat jelas pelipatgandaannya di dalam sel, warna inti sel menghitam;
Skor 3: bentuk inti sel beragam dan berukuran sangat besar, ukuran sitoplasma mulai mengecil, inti terlihat jelas pelipatgandaannya di
dalam sel, warna inti sel menghitam; c Tingkat mitosis sel
Tingkat mitosis sel tergantung dari jumlah lapang pandang . Pada penelitian ini menggunakan 5 lapang bidang pandang.
Skor 1: Jika sel yang bermitosis berjumlah 0-5 sel Skor 2: Jika sel yang bermitosis berjumlah 6-10 sel
Skor 3: Jika sel yang bermitosis berjumlah 11 sel
3.3.8. Pengujian TUNEL
Kategori