Metoda analisis marker kanker

2.8. Metoda analisis marker kanker

Analisis mikroskopi digunakan untuk mengamati jumlah sel kanker hidup yang akan ditransplantasikan, morfologi dan perubahan patologik, serta mendeteksi sel apoptosis kanker. Sel kanker hidup dan sel mati dibedakan dengan bantuan pewarna spesifik seperti tryphan blue kemudian mengamatinya di bawah mikroskop. Tryphan blue hanya menembus membran sel yang sudah mati. Jika sel mati menyerap tryphan blue maka tampak mengembang dan berwarna biru. Sebaliknya sel hidup tampak berpendar Doyle Griffiths 2000. Morfologi dan perubahan patologik dideteksi dengan bantuan pewarna hematoksilin eosin. Hematoksilin mewarnai kromatin dalam inti dengan warna ungu, sedangkan eosin akan mewarnai bagian sitoplasma organel dengan warna merah muda di bawah mikroskop Kiernan 1999. Sel apoptosis dideteksi secara mikroskopi dengan metode penandaan ujung DNA dengan pewarnaan TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT, mediated X-dUTP Nick End Labelling. Inti sel yang mengalami fragmentasi DNA pada akhir apoptosis menghasilkan fragmen DNA berberat molekul rendah, juga potongan untai tunggal nicks bagian dari DNA berberat molekul tinggi. Pada bagian ujung 3‘-OH bebas potongan DNA selanjutnya dideteksi dengan nukleotida dimodifikasi X-biotin-dUTP dengan penanda enzimatis Terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT end labeling. Sel yang telah terfragmentasi dengan enzim TdT selanjutnya direaksikan dengan substrat DAB. Sel apoptosis akan terlihat berwarna coklat karena menyerap DAB, sedangkan sel yang tidak mengalami apoptosis berwarna hijau di bawah mikroskop Roche 2010. Analisis aktivitas enzim caspase-7 dideteksi dengan teknik fluorosensi. Prinsip kerjanya bahwa enzim caspase-7 memotong substrat sintesis Z-DEVD, bis-N- CBZL-aspartyl-L-glutamyl-L-valyl-L-aspartic acid amide yang dikonjugasi dengan molekul fluoresen Rhodamin-110. Rhodamin-110 yang lepas dideteksi pada panjang gelombang 499 eksitasi dan 521 nm emisi Promega 2010. Keberadaan enzim pro-apoptosis caspase-7,-3, -9, PARP dan enzim proliferasi ERK12 dan JNK12 dideteksi menggunakan teknik Western blotting. Enzim pro-apoptosis dan proliferasi terlebih dahulu diidentifikasi menggunakan gel elektroforesis, lalu dipindahkan ke suatu membran, selanjutnya dideteksi dua tahap menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder yang dikonjugasi dengan enzim penanda untuk selanjutnya direaksikan dengan substrat DAB. Keberadaan enzim target dianalisis dengan Fuji Film Luminescent Image Analyzer LAS 3000 dan intensitas ekspresinya dikuantifikasi menggunakan program ImageJ. 3. METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan waktu Pembuatan ransum mencit C3H dilaksanakan di Pilot Plant SEAFAST Centre, IPB Bogor. Pemeliharaan dan pembedahan mencit, pembuatan preparat histopatologi dan pewarnaan Hematoksilin Eosin dilakukan di Laboratorium Patologi Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia FKUI, Jakarta. Pengujian Tunel dilakukan di Laboratorium Histologi dan Biologi Molekuler Lembaga Eikjman, Jakarta. Pengujian aktivitas dan ekspresi enzim caspase dilakukan di Laboratory of Nutritional Physiochemistry , Tokyo University of Agriculture and Technology, Jepang. Penelitian dimulai pada bulan Maret 2009 sampai dengan Januari 2011.

3.2. Bahan dan alat

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman cincau hijau Premna oblongifolia Merr yang diperoleh dari daerah Balumbang Jaya, Kecamatan Bogor Barat. Hewan percobaan yang digunakan terdiri dari 25 ekor mencit strain C3H sebagai mencit resipien berumur ± 2 bulan dengan bobot badan 20-22 g, dan 3 ekor mencit C3H berkanker kelenjar susu sebagai mencit donor, yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Eksperimental Bagian Patologi Anatomik FKUI, Jakarta. Bahan dan alat untuk pembuatan ransum Ransum standar terdiri dari kasein sebagai sumber protein, minyak jagung sebagai sumber lemak, tepung meizena sebagai sumber energi, dan CMC carboxyl methyl cellulose sebagai sumber serat. Ada pula vitamin mix merk Fitkom yang tiap tabletnya mengandung 1500 SI vitamin A, 1 mg tiamin, 0,5 mg riboflavin; 0,5 mg piridoksin; 10 mg niasin; 5 mg vitamin B; 0,5 mg asam folat; 0,5 mg vitamin B 12 , 25 mg vitamin C, vitamin B 5 dan vitamin D 2 150 SI dan mineral mix seperti yang terlihat pada Tabel 6 berikut ini: Peralatan untuk pembuatan ransum standar dan ransum uji seperti blender, drum dryer, oven, mixer, gelas ukur, labu ukur. Untuk pemeliharaan mencit digunakan peralatan antara lain: kandang terbuat dari plastik yang bagian atasnya ditutupi kawat berlubang rapat dilengkapi botol minum dari kaca, timbangan OHAUS dan kaliper merk Tayima untuk mengukur volume kanker.