3. METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan waktu
Pembuatan ransum mencit C3H dilaksanakan di Pilot Plant SEAFAST Centre, IPB Bogor. Pemeliharaan dan pembedahan mencit, pembuatan preparat
histopatologi dan pewarnaan Hematoksilin Eosin dilakukan di Laboratorium Patologi Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia FKUI, Jakarta. Pengujian Tunel dilakukan di Laboratorium Histologi dan Biologi Molekuler Lembaga Eikjman, Jakarta.
Pengujian aktivitas dan ekspresi enzim caspase dilakukan di Laboratory of Nutritional Physiochemistry
, Tokyo University of Agriculture and Technology, Jepang. Penelitian dimulai pada bulan Maret 2009 sampai dengan Januari 2011.
3.2. Bahan dan alat
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman cincau hijau Premna oblongifolia Merr yang diperoleh dari daerah Balumbang Jaya,
Kecamatan Bogor Barat. Hewan percobaan yang digunakan terdiri dari 25 ekor mencit strain C3H sebagai mencit resipien berumur ± 2 bulan dengan bobot
badan 20-22 g, dan 3 ekor mencit C3H berkanker kelenjar susu sebagai mencit donor, yang diperoleh dari Laboratorium Patologi Eksperimental Bagian Patologi
Anatomik FKUI, Jakarta.
Bahan dan alat untuk pembuatan ransum
Ransum standar terdiri dari kasein sebagai sumber protein, minyak jagung sebagai sumber lemak, tepung meizena sebagai sumber energi, dan
CMC carboxyl methyl cellulose sebagai sumber serat. Ada pula vitamin mix merk Fitkom yang tiap tabletnya mengandung 1500 SI vitamin A, 1 mg tiamin,
0,5 mg riboflavin; 0,5 mg piridoksin; 10 mg niasin; 5 mg vitamin B; 0,5 mg asam folat; 0,5 mg vitamin B
12
, 25 mg vitamin C, vitamin B
5
dan vitamin D
2
150 SI dan mineral mix seperti yang terlihat pada Tabel 6 berikut ini:
Peralatan untuk pembuatan ransum standar dan ransum uji seperti blender, drum dryer, oven, mixer, gelas ukur, labu ukur. Untuk pemeliharaan
mencit digunakan peralatan antara lain: kandang terbuat dari plastik yang bagian atasnya ditutupi kawat berlubang rapat dilengkapi botol minum dari kaca,
timbangan OHAUS dan kaliper merk Tayima untuk mengukur volume kanker.
Tabel 6. Komposisi mineral pada ransum mencit C3H
Jenis mineral Jumlah dalam 100 g
NaCl 139,30
KI 0,79
KH
2
PO 389,00
4
MgSO
4
.7H
2
57,30 O
CaCO 381,40
3
FeSO
4
. 7H
2
27,00 O
MnSO
4
. 7H
2
4,01 O
ZnSO
4
. 7H
2
0,55 O
CuSO
4
. 5H
2
0,48 O
CoCl
2
. 6H
2
0,02 O
Sumber: Chalid 2003
Bahan dan alat untuk transplantasi sel kanker dan pembedahan mencit
Eter untuk obat bius, buffer fosfat pH 7 untuk homogenisasi suspensi sel kanker, dan alkohol 70 untuk membersihkan bagian tubuh mencit yang akan
ditransplantasi. Zat-zat kimia ini diperoleh dari Laboratorium Patologi Eksperimental FKUI Jakarta. Untuk transplantasi sel kanker dan pembedahan
mencit digunakan peralatan antara lain: jarum trokar, gunting, pinset, cawan petri, kaca arloji steril.
Bahan dan alat untuk pembuatan preparat histopatologi
Larutan formalin 10, asam asetat glasial, parafin, silol, etanol 70 dan 60, larutan PBS phosphate buffer saline, larutan NaCl fisiologis 0,9.
Peralatan untuk pengolahan jaringan meliputi oven, cetakan antikarat, forsep, lemari pendingin serta gelas objek dan penutupnya. Pengamatan preparat
histopatologi menggunakan mikroskop cahaya.
Bahan untuk uji TUNEL
Potongan jaringan kanker setebal ± 4 µm yang diletakkan pada slide berlapis poly-L-lysine, pengujian apoptosis menggunakan In Situ Cell Death
Detection Kit , POD Roche, USA, larutan PBS, larutan NaCl fisiologis 0,85,
Proteinase K, DNAse I, buffer DNAse I Converter-POD, substrat DAB
diaminobenzidine, methyl green,dan entellan mounting medium. Peralatan yang digunakan sama dengan peralatan untuk pembuatan preparat histologi,
Suspensi sel kanker, Apoptosis Antibody Sampler Kit 9915, Cell Signaling Technology, USA, p4442 MAPK ERK12137F5 Rabbit mAb
4695, Cell Signalling Technology, USA, MAPK Kinase Activation Sampler Kit 612544, BD Transduction Laboratories, USA, Secondary antibody HRP Anti-
Rabbit 1:2000 Cell Signaling Technology, USA, GAPDH FL-335: sc-25778
Santa Cruz Biotechnology, Inc., substrat Lumiglo, membran PVDF Polyvinylidene fluoride. Peralatan yang digunakan antara lain
Bahan dan alat untuk uji Western Blotting
Fuji Film Luminescent image Analyzer
LAS-3000, piranti SDS-PAGE dan Western blotting.
Bahan dan alat untuk uji aktivitas caspase-7
Suspensi sel kanker, Apo-ONE Homogeneous Caspase-37 Assay Kit Promega, USA. Peralatan yang digunakan antara lain mikroplate 96 well merk
Nunc, spektrofotometer fluorosensi.
3.3. Tahapan penelitian
