slide dicuci kembali dengan PBS selama 2 menit 2 kali, lalu dikeringkan dengan kertas tissue.
Selanjutnya, slide ditetesi dengan converter-POD, kemudian ditutup coverslip lalu diinkubasi kembali pada suhu 37° C selama 30 menit. Setelah
inkubasi, slide dicuci PBS selama 2 menit 2 kali. Tahap berikutnya, slide diinkubasi dengan 100 µL larutan substrat DAB selama 15 menit. Untuk proses
counterstaining , ditambahkan methyl green pada setiap slide lalu didiamkan
selama 5 menit. Tahap akhir adalah proses dehidrasi dengan cara perendaman dalam
etanol bertingkat. Setelah kering, slide ditetesi entellan lalu ditutup coverslip dan dilihat di bawah mikroskop. Sel yang mengalami apoptosis akan berwarna coklat
karena menyerap DAB, sedangkan sel yang tidak mengalami apoptosis berwarna hijau. Jumlah sel yang berapoptosis dihitung untuk menentukan
Indeks Apoptosisnya dengan cara sebagai berikut:
Cara menghitung Indeks Apoptosis:
Setiap slide diamati di bawah mikroskop cahaya dengan Lapang Pandang Besar LPB 400x, kemudian diambil foto sebanyak 3 lapang pandang.
Pada setiap lapang pandang dihitung keseluruhan jumlah sel kanker inti sel berwarna hijau dan jumlah sel apoptosis inti sel berwarna coklat. Untuk setiap
perlakuan ada 5 slide. Perhitungan dilakukan secara ’blind” dan diulang dua kali pada waktu yang berbeda.
Nilai Indek Apoptosis IA dihitung dengan cara sebagai berikut:
Indeks apoptosis IA =
Nilai IA pada setiap lapang pandang tersebut dirata-rata untuk setiap slide. Nilai akhir dari setiap kelompok perlakuan merupakan rata-rata nilai IA setiap slide.
3.3.9. Ekstraksi jaringan kanker Yao 2003
Jaringan kanker mencit beku dithawing di dalam buffer homogenisasi dingin yang mengandung buffer RIPA 50 mmll bufer Tris-HCl pH 7,6; 150 mmol
NaCl, 1 Nonidet
®
P40; 0,5 Sodium deoxycholate, protease inhibitor cocktail 1x, 0,1 SDS dan inhibitor protease cocktail IPC Nacalai Tesque No.
Kat:25955, mengandung 4-2-Aminoethyl benzenesulfonyl fluoride hidrochloride, aprotinin from bovine lung
, E-64, leupeptine hemisulfate monohydrate, bestatin, pepstatin
A. Untuk setiap 10 mg jaringan kanker, ditambahkan 100 µL buffer RIPA, dan 1 µL IPC. Jaringan dicacah dengan gunting lalu dihomogenisasi
dalam kondisi di atas es. Setelah didiamkan selama 30 menit, suspensi sel disentrifugasi 14.000 g selama 10 menit pada 4
o
C lalu diambil supernatannya untuk uji protein. Supernatan mengandung protein sitosol, sedangkan peletnya
mengandung fraksi membran. Supernatan selanjutnya digunakan untuk pengujian kadar protein jaringan kanker berdasarkan metode Bradford 1976
menggunakan larutan standar Bovine Serum Albumin, BSA.
3.3.10 Uji aktivitas caspase-7 De Bello et al. 2007
Caspase-7 diukur dengan metode fluorometri menggunakan kit Apo- ONE
TM
Homogeneous Caspase 37 Assay Promega, USA. Enzim caspase-7 memotong substrat síntesis péptida DEVD asam aspartat-asam glutamat-valin-
asam aspartat yang dikonjugasi dengan molekul fluoresen Rhodamin 110. Fluorokrom yang lepas dideteksi pada panjang gelombang 499 nm. Aktivitas
caspase-7 dihitung dari nilai RFU sampel dikurangi dengan RFU blanko. RFU: Rate Fluoroscence Unit
. Selanjutnya unit aktivitas dan aktifitas spesifik caspase- 7 ditentukan.
3.3.11. Pengujian ekspresi enzim di jaringan kanker dengan teknik Western
blotting Tahapan Western Blotting terbagi 4 bagian, yaitu pembuatan gel
elektroforesis, blotting protein ke dalam membran PVDF, bloking membran dan inkubasi dengan antibodi, serta deteksi protein.
Pembuatan gel elektroforesis
Disiapkan bahan untuk running gel dan stacking gel. Running gel terdiri dari 1,5 M Tris-HCl pH 8,8; sterilized water dan bis-acrylamide 30 masing-
masing sebanyak 5 ml; 2,8 ml dan 10 ml. Dilakukan degassing selama 15 menit. Selanjutnya ditambahkan 10 SDS, 1,5 APS dan TEMED masing-masing
sebanyak 0,2 ml; 2 ml dan 0,002 ml. Kesemua bahan dicampurkan menggunakan mikropipet, lalu dituang ke dalam cetakan gel berukuran 10x10 cm
sebanyak masing-masing 5 ml untuk running gel. Gel akan memadat setelah
sekitar 30 menit. Untuk memastikan gel telah padat dengan cara menambahkan MQ water di atas running gel. Jika tidak timbul gelembung diantara gel, maka
gel sudah benar-benar memadat. Selanjutnya, stacking gel dituangkan di atas running gel, dan segera
dipasang sisir berisi 14 sumur untuk loading sampel dan ditunggu hingga gel memadat sekitar 10 menit. Sambil menunggu gel membeku, disiapkan buffer
elektroforesis 360 ml MQ water dan 40 ml 10x buffer elektroforesis. Loading sampel sebanyak 20 µl persumur dan 3 µl untuk marker. Sampel merupakan
protein hasil ekstraksi yang terdiri dari 4 kelompok perlakuan B,C,D,E masing- masing 3 sampel. Elektroforesis diatur pada tegangan 100 Volt dan arus 30 mA
selama 120 menit. Setelah selesai, gel dicuci dengan MQ water dan protein target di dalam gel siap diblotting ke dalam membran PVDF.
Blotting protein
Menyiapkan piranti Western blotting dengan susunan lapisan sandwich sebagai berikut dari bawah ke atas: busa, kertas Whatman 4 lembar, membran
PVDF, gel target, kertas Whatman 4 lembar kembali, terakhir busa. Sisir piranti Western blotting ditutup lalu ditempatkan dalam wadah. Sebelum diblotting,
membrane PVDF direndam terlebih dahulu dalam methanol beberapa detik dengan digoyang perlahan, kemudian direndam di dalam 10x buffer transfer
selama 30 menit agar protein dapat terblotting sempurna ke dalamnya. Tegangan listrik diatur pada 100 Volt, arus 2 Amp selama satu jam, dan piranti
selalu ditempatkan dalam kondisi dingin di atas es di dalam cool room.
Bloking membran dan inkubasi dengan antibodi
Membran PVDF yang telah berisi protein target dicuci dalam TBS selama 5 menit dua kali. Selanjutnya membran diinkubasi dengan blocking buffer 5
skim milk dalam TBST selama satu jam pada suhu kamar. Setelah itu, membran dicuci dengan TBST tiga kali masing-masing 5 menit. Berikutnya, inkubasi
membran dengan antibodi Caspase-7 1:1000, Caspase-9 1:1000, Caspase-3 1:1000, PARP 1:1000, ERK12 dan JNK 12 selama semalam. Setelah itu
membran dicuci dengan TBST kembali selama 5 menit tiga kali. Antibodi sekunder yang dikonjugasi dengan enzim Horse Redish Peroxidase HRP yang
berikatan dengan antibodi pendeteksi anti-rabbit 1:2000 diinkubasi selama satu jam, lalu dicuci kembali dengan TBST tiga kali masing-masing 5 menit.
Deteksi protein
Membran yang telah diinkubasi dengan antibodi primer dan antibodi sekunder yang berkonjugasi dengan enzim selanjutnya diinkubasi dengan
substrat LumiGlo selama satu menit dengan agitasi pada suhu ruang. Reaksi enzim substrat menghasilkan senyawa chemiluminesense yang intensitasnya
diukur dengan alat Fuji Film Luminescence Image AnalyzerLAS 3000. Substrat LumiGlo berisi MQ Water, larutan peroksida, dan larutan enhancher Luminol
dengan perbandingan 6:1:1.
Kuantifikasi ekspresi protein dengan densitometer.
Setelah membran diekspos menggunakan LAS-3000, pita yang terdeteksi dikuantifikasi menggunakan suatu program komputer bernama ImageJ versi
V1.41, USA. Nilai ekspresi protein dinormalisasi dengan internal loading control menggunakan GAPDH. Langkah-langkah pengukuran disesuaikan dengan
petunjuk pada manual alat. Data hasil pengukuran dengan densitometer selanjutnya dianalisa secara statistik.
3.3.12 Analisis data
