61
3.4.7. Analisis Profil Gelatinisasi Pati RVA Standar 2
Profil gelatinisasi pati garut alami dianalisis dengan menggunakan Rapid Visco Analyzer
RVA. Sebanyak 3,0 g sampel berat kering ditimbang dalam wadah RVA, lalu ditambahkan 25,0 g akuades. Pengukuran dengan RVA menca-
kup fase proses pemanasan dan pendinginan pada pengadukan konstan 160 rpm. Pada fase pemanasan, suspensi pati dipanaskan dari suhu 50
o
C hingga 95
o
C dengan kecepatan 6
o
Cmenit, lalu dipertahankan pada suhu tersebut holding selama 5 menit. Setelah fase pemanasan selesai, pasta pati dilewatkan pada fase
pendinginan, yaitu suhu diturunkan dari 95
o
C menjadi 50
o
C dengan kecepatan 6
o
Cmenit, kemudian dipertahankan pada suhu tersebut selama 2 menit. Instrumen RVA memplot kurva profil gelatinisasi sebagai hubungan dari nilai viskositas cP
pada sumbu y dengan perubahan suhu
o
C selama fase pemanasan dan pendi-
nginan pada sumbu x Gambar 21.
Gambar 21. Profil kurva gelatinisasi pati dengan Rapid Visco Analyzer RVA
Data yang diperoleh dari pengukuran RVA adalah suhu awal gelatinisasi SAG, viskositas puncak atau maximum viscosity MV, viskositas pada 95
o
C atau hot paste viscosity HPV, viskositas breakdown VB, viskositas setelah
mencapai suhu 50
o
C, viskositas akhir setelah dipertahankan di 50
o
C atau cold paste viscosity
CPV, viskositas setback atau setback viscosity SV, dan stabili-
62 tas pengadukan pada 50
o
C. SAG
o
C adalah suhu pada saat nilai viskositas mulai terbaca yang menandakan pati mulai mengalami gelatinisasi. MV diukur saat
pasta pati mencapai viskositas maksimum selama fase pemanasan. VB menunjuk- kan kestabilan viskositas terhadap pemanasan yang dihitung dari selisih antara PV
dengan HPV. SV menunjukkan kecenderungan pati untuk mengalami retrogra- dasi yang dihitung sebagai selisih antara CPV dengan HPV. Tipe profil gelatini-
sasi pati selanjutnya ditentukan berdasarkan pengelompokan oleh Schoch dan Maywald 1968.
3.4.8. Analisis Morfologi Pati
Perubahan morfologi pati garut sebelum dan setelah perlakuan modifikasi diamati dengan menggunakan mikroskop polarisasi dan Scanning Electron
Microscope SEM sebagai berikut.
3.4.8.1. Mikroskop Polarisasi Ridal 2003
Pati garut alami dibuat suspensi encer dengan melarutkan 1 sudip sampel dalam + 20 mL air. Selanjutnya beberapa tetes suspensi diambil dan diletakkan di
atas sebuah gelas objek. Gelas penutup dipasang, lalu preparat diamati dengan menggunakan mikroskop polarisasi cahaya pada skala pembesaran 200 kali dan
gambar yang teramati dipotret dengan kamera dan foto granula pati yang dihasil- kan dicetak pada film. Ukuran granula pati dibaca dari gambar dalam satuan
μm.
3.4.8.2. Scanning Electron Microscope Srichuwong 2006
Morfologi permukaan granula pati garut sebelum dan setelah modifikasi
diamati di bawah Scanning Electron Microscope SEM. Serbuk pati diletakkan di
atas tempat sampel dengan menggunakan isolasi double-side. Sampel kemudian dilapisi
dengan emas, lalu dimasukkan ke dalam instrumen SEM. Struktur pati diamati di layar monitor dengan menggunakan skala pembesaran 500 dan 800
kali. Hasil pengamatan kemudian difoto dengan menggunakan kamera digital.
3.4.9. Analisis Perubahan Struktur Pati Garut
Perubahan struktur pati garut sebelum dan setelah perlakuan modifikasi diamati dengan menganalisis distribusi amilosa dan amilopektin dengan GPC dan
distribusi panjang rantai amilopektin dengan FACE sebagai berikut.
63
3.4.9.1. Distribusi Amilosa dan Amilopektin Sunarti et al. 2001; Ozturk et al.
2009
Analisis distribusi amilosa dan amilopektin dilakukan dengan menggunakan Gel Permeation Chromatography
GPC. Analisis mencakup tahapan persiapan sampel dan injeksi sampel ke dalam GPC.
Persiapan Sampel
Tahapan persiapan sampel bertujuan menghilangkan lemak dalam sampel
pati garut. Sebanyak 2,0 g sampel disuspensikan ke dalam 40 mL dimetil sulfok-
sida DMSO dan disimpan pada penangas bergoyang pada suhu 37
o
C selama 12 jam. Suspensi sampel kemudian dituangkan sedikit demi sedikit ke dalam 100,0
mL etanol dan disimpan pada suhu 4
o
C selama selama 12 jam. Sampel disaring dengan menggunakan 3G-4 glass-filter dan dicuci 4 kali dengan etanol. Sampel
kemudian dikeringkan di dalam desikator.
Injeksi Sampel ke Dalam GPC
Sampel pati garut yang sudah dihilangkan lemaknya 40,0 mg ditimbang dan ditambahkan 20,0 mL akuades dalam tabung sentrifus 15 mL, sehingga diper-
oleh konsentrasi suspensi pati 2,0 mgmL. Tabung sentrifus berisi sampel tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan di dalam otoklaf pada
suhu 105
o
C selama 1 jam. Larutan pati diaduk dengan vorteks, lalu disentrifusi pada 1.000g selama 10 menit pada suhu 4
o
C. Supernatan yang diperoleh kemu- dian dianalisis total karbohidratnya
dengan metode fenol-sulfat Dubois et al. 1956 sebelum diinjeksikan dalam kolom GPC. Total karbohidrat yang diinjeksi-
kan ke dalam kolom memiliki konsentrasi antara 4-6 mg per 10 mL. Fase gerak yang digunakan adalah 50 mM NaCl. Kondisi yang digunakan dalam analisis
GPC adalah sebagai berikut. Gel
: Toyopearl HW-65S Tosoh Co, Japan Ukuran sampel : 2,6 cm ID x 100 cm
Eluen : NaCl 50 mM
Laju alir : 60 mljam
Volumetabung : 10,0 ml Volume injeksi : 10,0 ml
64 Sampel pada setiap nomor fraksi dari hasil pemisahan GPC ditampung dan
dianalisis kadar total karbohidratnya dengan menggunakan metode fenol-sulfat Dubois et al. 1956. Persentase nisbah karbohidrat ditentukan dari kadar total
karbohidrat setiap nomor fraksi dibagi dengan total jumlah karbohidrat seluruh nomor fraksi. Selanjutnya dibuat plot hubungan antara nomor fraksi pada sumbu
x dan persen nisbah karbohidrat pada sumbu y. Kurva GPC dikelompokkan menjadi dua 2 kelompok fraksi I dan II. Fraksi I merupakan penjumlahan dari
nomor fraksi 1-30 dan fraksi II dari nomor fraksi 31-48. Masing-masing fraksi I dan II ditentukan persentasenya dengan menghitung jumlah total karbohidrat di
masing-masing fraksi dengan total karbohidrat seluruh fraksi. Persentase pening- katan fraksi II
dihitung dari sebagai selisih persentase fraksi II dari pati modifikasi dengan fraksi II dari pati alami dibagi dengan fraksi II pati alami.
3.4.9.2. Distribusi Panjang Rantai Amilopektin Srichuwong et al. 2005a
Analisis distribusi panjang rantai amilopektin dan amilosa rantai pendek dari pati garut dan pati garut yang dimodifikasi diukur dengan Fluorophore-
Assisted Capillary Electrophoresis FACE. Analisis mencakup tahap persiapan
sampel, dan analisis dengan FACE sebagai berikut.
Persiapan Sampel
Sampel pati garut 10,0 mg ditimbang dan ditambahkan 5,0 mL akuades dalam tabung sentrifus 15 mL, sehingga diperoleh konsentrasi suspensi pati 2,0
mgmL. Tabung sentrifus berisi sampel tersebut kemudian ditutup dengan alumi- nium foil dan dipanaskan di dalam otoklaf pada suhu 105
o
C selama 1 jam. Larutan pati diaduk dengan vorteks, kemudian dipindahkan sebanyak 100
μL ke dalam tabung reaksi suhu di bawah 37
o
C. Ke dalam tabung reaksi tersebut kemudian ditambahkan 5
μL 50 mM bufer asetat pH 3,5 dan 5 μL larutan enzim isoamilase yang sudah dimurnikan. Sampel diaduk kembali dengan vorteks dan
disimpan di dalam inkubator 37
o
C selama 24 jam. Larutan yang telah diinkubasi tersebut kemudian dididihkan pada suhu
100
o
C selama 5 menit dan disentrifusi pada 1.500g selama 5 menit. Sebanyak 50 μL supernatan dikeringkan dengan menggunakan evaporator, lalu ditambahkan 2
μL larutan NaBH
3
CN 1 M dan 2 μL APTS 0,2 M 8-aminopyrene-1,3,6-trisul-
65 furic acid trisodium
. Setelah diaduk dengan menggunakan vorteks, sampel disim- pan kembali di dalam inkubator 37
o
C selama 24 jam. Selanjutnya sampel ditam- bah 1 mL akuades, diaduk dengan vorteks, dan disimpan di dalam freezer -30
o
C sebelum dianalisis dengan menggunakan FACE.
Analisis Sampel
Sampel beku yang telah di-thawing diencerkan 3000 kali dan 6000 kali, kemudian dipipet sebanyak 20
μL. Larutan sampel dimasukkan ke dalam 96-well dan disentrifusi. Larutan sampel yang berada di dalam 96-well dimasukkan ke
dalam Genetic Analyzer dengan polimer POP-6 dan 36 cm kapiler FACE. Alat elektroforesis dijalankan dengan bufer Genetic Analyzer pada 15kV selama 2 jam.
Data yang diperoleh dari pengukuran FACE diolah dengan menggunakan soft- ware
Genescan 3.7 Applied Biosystems untuk menghasilkan kurva hubungan antara derajat polimerasi DP amilopektin atau amilosa rantai pendek DP 6-30
pada sumbu x dan persen distribusi panjang rantai amilopektin atau amilosa rantai pendek pada sumbu y. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan
Δdistribusi DP yang dihitung dari selisih persen distribusi DP pada masing-masing perlakuan
dengan persen distribusi DP pada pati garut alami dinyatakan dalam persen. Selanjutnya dibuat plot hubungan antara persen
Δ distribusi DP pada sumbu y dengan derajat polimerisasi pada sumbu x. Pengelompokan fraksi amilosa rantai
pendek hasil perlakuan modifikasi ditentukan menurut Hizukuri 1986, yaitu DP 6-8, 9-12, 13-24, dan 25-30. Setiap kelompok DP tersebut dihitung dengan cara
menjumlahkan persen distribusi untuk setiap DP dalam kelompoknya.
3.4.10. Analisis Kestabilan Panas dan Derajat Retrogradasi Wang et al.
2003
Analisis kestabilan panas dan derajat retrogradasi pati sebelum dan setelah modifikasi dapat diukur dengan menggunakan Differential Scanning Calorimetry
DSC. Sebelum analisis sampel dilakukan, DSC dikalibrasi dahulu dengan meng- gunakan indium. Sebanyak 3,0 mg sampel ditempatkan dalam wadah aluminium
hermetis. Air deionisasi ditambahkan sebanyak 10 μL ke dalam wadah aluminium
tersebut, kemudian dikelim dengan rapat dan disimpan di dalam refrigerator pada suhu 4
o
C selama 12 jam .
Sampel dianalisis dengan menggunakan DSC dengan
66 suhu awal 30
o
C dan dipertahankan selama 3 menit. Suhu dinaikkan secara berta- hap hingga suhu 250
o
C dengan kenaikan 5
o
Cmenit. DSC memplot kurva hubungan antara suhu pada sumbu x dengan aliran panas endothermic heat flow
pada sumbu y Gambar 22.
Gambar 22 . Kurva Differential Scanning Calorimetry
DSC. T
o
onset temperature, T
p
peak temperature
, T
c
conclusion temperature Data-data yang diperoleh untuk menunjukkan kestabilan pati terhadap panas
adalah suhu onset atau onset temperature T
o
, suhu puncak atau peak tempera- ture
T
p
, dan suhu akhir atau conclusion temperature T
c
. Nilai entalpi ΔH, Jg
ditentukan dari daerah di bawah kurva antara T
o
dan T
c
Gambar 22. Derajat
retro-gradasi dari pati garut dihitung sebagai persentase dari nilai ΔH pati
yang telah dimodifikasi terhadap ΔH pati alami sebelum dimodifikasi.
3.4.11. Analisis Sifat Kristalinitas