48
b Penentuan waktu dan siklus autoclaving-cooling. Tahapan penelitian dila-
kukan seperti di atas pada suhu pemanasan awal yang terpilih, tetapi dengan waktu autoclaving 15 dan 30 menit dan jumlah siklus autoclaving-cooling
sebanyak 1, 3, dan 5 siklus. Pati garut hasil proses modifikasi 3.2.2.1a di atas kemudian dianalisis daya
cerna pati in vitro, kadar amilosa, gula pereduksi, dan pati resisten. Pati yang dimodifikasi pada tahap 3.2.2.1b di atas dianalisis kadar pati resisten dan daya
cerna pati in vitro-nya.
3.3.2.2. Penentuan Kondisi Hidrolisis Asam
Tahap penelitian ini bertujuan menentukan konsentrasi asam klorida HCl dan waktu inkubasi yang digunakan untuk hidrolisis asam secara lambat sebagai
berikut: Sebanyak 250 g pati garut disuspensikan dalam larutan HCl nisbah 1:1 dengan konsentrasi yang berbeda HCl 1,1N dan 2,2N. Suspensi pati diinkubasi
pada suhu 35
o
C dengan waktu yang berbeda 2, 4, dan 6 jam dengan terus dila- kukan pengadukan. Suspensi pati garut yang telah mengalami perlakuan hidrolisis
asam tersebut kemudian dinetralkan dengan menggunakan larutan natrium hidrok- sida NaOH 1M hingga mencapai pH 6,0. Suspensi pati tersebut kemudian dike-
ringkan pada suhu 50
o
C selama 24 jam hingga mencapai kadar air 10-12. Sete- lah kering, pati digiling dengan menggunakan disc mill dan disaring dan diayak
kemudian dikemas dan disimpan di dalam freezer -18
o
C sampai digunakan. Pati garut hasil hidrolisis asam 20,0 g dalam erlenmeyer 300 mL disuspen-
sikan kembali dalam akuades 20bv, kemudian diberi perlakuan pemanasan awal pada suhu yang terpilih dari tahap 3.3.2.1a dan dipanaskan di dalam
otoklaf 121
o
C pada waktu dan siklus autoclaving-cooling terpilih dari tahap 3.3.2.1b. Sampel yang telah diberi perlakuan didinginkan selama 1 jam pada
suhu ruang dan selanjutnya disimpan dalam refrigerator 4
o
C selama 24 jam. Sam- pel pati garut dari perlakuan tersebut kemudian dikeringkan, digiling, diayak,
dikemas dan disimpan dalam freezer -18
o
C sampai digunakan. Pati garut hasil modifikasi dengan perlakuan di atas dianalisis daya cerna
pati in vitro dan kadar amilosanya.
49
3.3.2.3. Penentuan Kondisi Debranching
Tahap penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas enzim pullulanase, konsentrasi enzim pullulanase, dan waktu inkubasi. Hasil penelitian pada tahap ini
digunakan dalam penelitian tahap III.
a Pengujian aktivitas enzim pullulanase Gonzalez-Soto et al. 2004 dan
2007
. Larutan enzim pullulanase dibuat dengan cara menambahkan 30 μL
larutan enzim pullulanase stok dan ditambahkan 720 μL asetat bufer pH 5,2
dan 0,1 M. Sebanyak 62,5 μL larutan enzim tersebut ditambahkan dengan
125 μL larutan waxy maize 0,4 mgmL dan 62,5 μL larutan asetat bufer 0,1
M dan pH 5,2. Campuran larutan tersebut kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 50
o
C. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 0,5 mL larutan 0,5 M NaOH. Kadar gula pereduksi glukosa ditentukan dengan
menggunakan metode Park-Johnson Takeda et al. 1993. Aktivitas enzim pullulanase dinyatakan dalam
μmolmenit atau UmL diperoleh dengan membagi kandungan glukosa dalam
μmol dibagi dengan waktu inkubasi 10 menit.
b Penentuan konsentrasi dan waktu inkubasi Gonzales-Soto et al. 2004.
Larutan pati garut 20bv kemudian diberi perlakuan pemanasan awal pada suhu yang terpilih dari tahap 3.3.2.1a dan dipanaskan di dalam otoklaf 121
o
C pada waktu dan siklus autoclaving-cooling terpilih tahap 3.3.2.1b. Gel pati
yang terbentuk kemudian diencerkan dengan air deionisasi sampai konsentrasi 10 bv. Enzim pullulanase ditambahkan pada konsentrasi yang berbeda 1,3;
5,2; dan 10,4 Ug pati, kemudian diinkubasi pada suhu 50
o
C dengan waktu yang berbeda 0, 16, 24 dan 40 jam. Inaktivasi enzim pullulanase dilakukan
dengan pemanasan di atas penangas air 100
o
C selama 10 menit. Pati garut hasil proses modifikasi 3.3.2.3a dan b di atas dianalisis kadar
gula pereduksinya metode Park-Johnson, Takeda et al. 1993. Data gula pere- duksi digunakan untuk menentukan derajat hidrolisis pati oleh enzim pullulanase,
yaitu dengan membagi kadar gula pereduksi setelah waktu hidrolisis tertentu dengan konsentrasi gula pereduksi tertinggi selama proses hidrolisis dinyatakan
dalam persen.
50
3.3.2.4. Analisis Statistika
