64 Sampel pada setiap nomor fraksi dari hasil pemisahan GPC ditampung dan
dianalisis kadar total karbohidratnya dengan menggunakan metode fenol-sulfat Dubois et al. 1956. Persentase nisbah karbohidrat ditentukan dari kadar total
karbohidrat setiap nomor fraksi dibagi dengan total jumlah karbohidrat seluruh nomor fraksi. Selanjutnya dibuat plot hubungan antara nomor fraksi pada sumbu
x dan persen nisbah karbohidrat pada sumbu y. Kurva GPC dikelompokkan menjadi dua 2 kelompok fraksi I dan II. Fraksi I merupakan penjumlahan dari
nomor fraksi 1-30 dan fraksi II dari nomor fraksi 31-48. Masing-masing fraksi I dan II ditentukan persentasenya dengan menghitung jumlah total karbohidrat di
masing-masing fraksi dengan total karbohidrat seluruh fraksi. Persentase pening- katan fraksi II
dihitung dari sebagai selisih persentase fraksi II dari pati modifikasi dengan fraksi II dari pati alami dibagi dengan fraksi II pati alami.
3.4.9.2. Distribusi Panjang Rantai Amilopektin Srichuwong et al. 2005a
Analisis distribusi panjang rantai amilopektin dan amilosa rantai pendek dari pati garut dan pati garut yang dimodifikasi diukur dengan Fluorophore-
Assisted Capillary Electrophoresis FACE. Analisis mencakup tahap persiapan
sampel, dan analisis dengan FACE sebagai berikut.
Persiapan Sampel
Sampel pati garut 10,0 mg ditimbang dan ditambahkan 5,0 mL akuades dalam tabung sentrifus 15 mL, sehingga diperoleh konsentrasi suspensi pati 2,0
mgmL. Tabung sentrifus berisi sampel tersebut kemudian ditutup dengan alumi- nium foil dan dipanaskan di dalam otoklaf pada suhu 105
o
C selama 1 jam. Larutan pati diaduk dengan vorteks, kemudian dipindahkan sebanyak 100
μL ke dalam tabung reaksi suhu di bawah 37
o
C. Ke dalam tabung reaksi tersebut kemudian ditambahkan 5
μL 50 mM bufer asetat pH 3,5 dan 5 μL larutan enzim isoamilase yang sudah dimurnikan. Sampel diaduk kembali dengan vorteks dan
disimpan di dalam inkubator 37
o
C selama 24 jam. Larutan yang telah diinkubasi tersebut kemudian dididihkan pada suhu
100
o
C selama 5 menit dan disentrifusi pada 1.500g selama 5 menit. Sebanyak 50 μL supernatan dikeringkan dengan menggunakan evaporator, lalu ditambahkan 2
μL larutan NaBH
3
CN 1 M dan 2 μL APTS 0,2 M 8-aminopyrene-1,3,6-trisul-
65 furic acid trisodium
. Setelah diaduk dengan menggunakan vorteks, sampel disim- pan kembali di dalam inkubator 37
o
C selama 24 jam. Selanjutnya sampel ditam- bah 1 mL akuades, diaduk dengan vorteks, dan disimpan di dalam freezer -30
o
C sebelum dianalisis dengan menggunakan FACE.
Analisis Sampel
Sampel beku yang telah di-thawing diencerkan 3000 kali dan 6000 kali, kemudian dipipet sebanyak 20
μL. Larutan sampel dimasukkan ke dalam 96-well dan disentrifusi. Larutan sampel yang berada di dalam 96-well dimasukkan ke
dalam Genetic Analyzer dengan polimer POP-6 dan 36 cm kapiler FACE. Alat elektroforesis dijalankan dengan bufer Genetic Analyzer pada 15kV selama 2 jam.
Data yang diperoleh dari pengukuran FACE diolah dengan menggunakan soft- ware
Genescan 3.7 Applied Biosystems untuk menghasilkan kurva hubungan antara derajat polimerasi DP amilopektin atau amilosa rantai pendek DP 6-30
pada sumbu x dan persen distribusi panjang rantai amilopektin atau amilosa rantai pendek pada sumbu y. Berdasarkan kurva tersebut ditentukan
Δdistribusi DP yang dihitung dari selisih persen distribusi DP pada masing-masing perlakuan
dengan persen distribusi DP pada pati garut alami dinyatakan dalam persen. Selanjutnya dibuat plot hubungan antara persen
Δ distribusi DP pada sumbu y dengan derajat polimerisasi pada sumbu x. Pengelompokan fraksi amilosa rantai
pendek hasil perlakuan modifikasi ditentukan menurut Hizukuri 1986, yaitu DP 6-8, 9-12, 13-24, dan 25-30. Setiap kelompok DP tersebut dihitung dengan cara
menjumlahkan persen distribusi untuk setiap DP dalam kelompoknya.
3.4.10. Analisis Kestabilan Panas dan Derajat Retrogradasi Wang et al.
