b. transisi n → σ
. Senyawa-senyawa jenuh yang mengandung atom-atom dengan elektron-elektron tak berpasangan elektron non bonding mempunyai
kemampuan untuk mengadakan transisi n → σ
. Pasangan elektron bebas tersebut akan dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi karena elektron non bonding
tidak terikat terlalu kuat seperti elektron bonding σ, sehingga serapannya terjadi pada
panjang gelombang yang lebih besar. Akibatnya, transisi ini memerlukan energi yang lebih kecil daripada transisi
σ →σ dan dapat disebabkan oleh radiasi di daerah
antara 150-250 nm, dengan kebanyakan puncak absorpsi tampak pada panjang gelombang di bawah 200 nm.
c. transisi n → π
dan π → π
. Umumnya penggunaan spektroskopi serapan pada senyawa-senyawa organik didasarkan pada transisi elektron n dan
π ke π .
Energi yang dibutuhkan cukup rendah yaitu pada daerah sekitar 200-700 nm. Diagram tingkat energi elektronik dapat dilihat pada gambar 6 berikut:
σ Anti bonding
π Anti bonding
E n
Non bonding π
Bonding σ
Bonding
Gambar 6. Diagram tingkat energi elektronik
4. Interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik
Radiasi elektromagnetik dapat berinteraksi dengan molekul dalam berbagai cara. Jika interaksinya menghasilkan transfer energi dari sumber radiasi kepada
molekul maka dinamakan absorpsi Pecsok dkk., 1976. Agar dapat mengabsorpsi radiasi UV-Vis, suatu molekul membutuhkan gugus yang dinamakan kromofor yang
merupakan suatu gugus kovalen tak jenuh terkonjugasi yang bertanggungjawab untuk absorpsi radiasi UV-Vis Fell, 1986. Selain itu, dikenal pula auksokrom yang
merupakan gugus yang mengandung heteroatom yang memberikan transisi n → σ
. Terikatnya gugus auksokrom oleh gugus kromofor secara langsung akan
mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke λ yang lebih panjang, disertai
peningkatan atau penurunan intensitas Mulja dan Suharman, 1995.
5. Analisis kuantitatif secara spektrofotometri UV-Vis
Analisis kuantitatif zat tunggal dilakukan dengan mengukur nilai serapan A pada panjang gelombang yang memberikan serapan maksimum. Nilai serapan
A digambarkan oleh suatu hukum yang disebut hukum Lambert-Beer. a. Hukum Lambert menyatakan bahwa intensitas cahaya yang
ditransmisikan menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan tebal zat penyerap.
b. Hukum Beer menyatakan bahwa intensitas cahaya yang ditransmisikan menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan konsentrasi zat penyerap.
Kombinasi kedua hukum tersebut menghasilkan hukum Lambert-Beer yang menyatakan hubungan antara logaritma intensitas sinar yang masuk dengan sinar
yang keluar sebagai fungsi tebal zat penyerap dan konsentrasi zat penyerap, dirumuskan sebagai berikut:
Log IoI = a.c.b = A PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Dengan: a = daya serap
c = konsentrasi larutan b = tebal kuvet
A = serapan Io = intensitas energi yang mencapai cuplikan
I = intensitas pancaran yang dikeluarkan dari cuplikan.
Nilai a atau daya serap menggambarkan nilai serapan yang spesifik dan sering disebut
A
cm 1
1
yang artinya serapan larutan dengan konsentrasi 1 bv dengan pelarut tertentu pada kuvet setebal 1 cm adalah suatu angka yang spesifik Fell,
1986.
6. Serapan suatu larutan
Serapan adalah karakteristik untuk suatu larutan senyawa pada suatu panjang gelombang. Hubungan serapan dengan daya serap molar digambarkan
dengan rumus ε = a . M, dimana M adalah berat molekul senyawa Silverstein dkk.,
1991. Penyinaran senyawa organik tidak selalu diikuti oleh eksitasi elektron baik
dari orbital ikatan atau pasangan elektron bebas ke orbital non ikatan. Pernyataan ini dapat dituang dalam persamaan berikut ini:
ε = 0,87 x 10
20
x P x a keterangan:
P = probabilitas transisi elektron dengan nilai antara 0-1
a = panjang kromofor
Kromofor dengan panjang gelombang 1 nm akan memberikan nilai daya serap molar
ε sebesar 10
5
. Pada prakteknya kromofor yang menyerap cahaya dengan diikuti terjadinya transisi penuh akan memiliki nilai daya serap molar
ε lebih dari 10.000, sedang yang probabilitas transisinya rendah akan memiliki daya
serap molar ε yang kurang dari 1000 Williams dan Fleming, 1980. Nilai serapan
jenis adalah karakteristik penyerapan molekul pada pelarut dan panjang gelombang tertentu, dan tidak tergantung konsentrasi serta lamanya radiasi Pecsok dkk., 1976.
7. Kesalahan fotometrik
Ketepatan dan ketelitian pembacaan intensitas sinar yang sampai pada detektor digambarkan sebagai nilai kesalahan fotometrik. Ketepatan fotometrik
berkurang pada nilai serapan rendah maupun pada nilai serapan tinggi. Pada serapan yang rendah, intensitas sinar yang ditransmisikan baik ada maupun tidak ada sampel
hampir sama sehingga kemungkinan terjadinya kesalahan sangat besar. Hal tersebut karena ada keterbatasan kepekaan detektor. Pada serapan yang tinggi, intensitas sinar
yang sampai pada detektor sangat rendah sehingga tidak dapat diukur dengan tepat Pecsok dkk., 1976.
Untuk pembacaan serapan A atau transmitan T pada daerah terbatas, kesalahan penentuan kadar hasil analisis dinyatakan sebagai:
C C
Δ =
T log
4343 ,
x T
T Δ
ΔT adalah nilai rentang skala transmitan terkecil dari alat yang masih dapat terbaca pada analisis dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Nilai
ΔT untuk setiap spektrofotometer UV-Vis biasanya bervariasi 0,2-1 dan selalu dicantumkan
sebagai spesifikasi instrumen. Dari rumus tersebut di atas dapat diperhitungkan kesalahan pembacaan A atau T pada analisis dengan metode spektrofotometer UV-
Vis. Pembacaan A 0,2-0,8 atau T 15-65 akan memberikan prosentase PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kesalahan analisis yang dapat diterima yaitu sebesar 0,5-1 untuk ΔT = 1 Mulja
dan Suharman, 1995. Apabila pengukuran dilakukan di luar rentang A 0,2-0,8 atau T 15-
65, maka sebaiknya dalam pengukuran digunakan panjang gelombang yang paling tepat dan menggunakan sel dengan pencahayaan paling tepat. Hal ini untuk
menghindari besarnya kesalahan pembacaan serapan, yang berakibat pada kesalahan penetapan kadar Pecsok, 1976.
8. Syarat-syarat penggunaan Hukum Beer Skoog, 1985
a. syarat konsentrasi. Penyimpangan Hukum Beer dapat disebabkan dari nilai yang
tergantung dari indeks bias larutan. Hubungan tersebut dapat dilihat dari persamaan berikut Willard dkk., 1988:
Besar penyimpangan =
2 2
2 .
+ n
n ε
Keterangan: ε = daya serap molar
n = indeks bias larutan
Pada konsentrasi 0,01 M, indeks bias larutan relatif konstan tetapi pada konsentrasi tinggi indeks bias ternyata berubah sehingga perlu dikoreksi
agar diperoleh nilai serapan yang sesuai. Pada konsentrasi tinggi, jarak rata-rata diantara zat-zat pengabsorpsi
menjadi kecil sehingga masing-masing zat mempengaruhi distribusi muatan tetangganya. Interaksi ini dapat mengubah kemampuan untuk mengabsorpsi
cahaya pada panjang gelombang yang diberikan. Oleh karena interaksi ini PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
bergantung pada konsentrasi, maka peristiwa ini menyebabkan penyimpangan dari kelinieran hubungan antara absorpsi dengan konsentrasi.
Pengaruh serupa kadang-kadang terjadi di dalam larutan yang mengandung konsentrasi zat pengabsorpsi yang rendah tetapi konsentrasi zat non-
pengabsorpsinya tinggi, terutama elektrolit. Interaksi elektrostatis ion-ion yang berdekatan dengan zat pengabsorpsi akan mempengaruhi nilai
absorptivitas molar. Pengaruh ini dapat dihindari dengan cara pengenceran. b. syarat kimia.
Zat pengabsorpsi tidak boleh terdisosiasi, berasosiasi, atau bereaksi dengan pelarut menghasilkan suatu produk pengabsorpsi spektrum yang
berbeda dari zat yang dianalisis. c. syarat cahaya.
Hukum Beer hanya berlaku untuk cahaya yang betul-betul monokromatik cahaya yang mempunyai satu macam panjang gelombang.
d. syarat kejernihan. Kekeruhan larutan misalnya yang disebabkan oleh partikel-partikel
koloid akan menyebabkan penyimpangan hukum Beer. Sebagian cahaya akan dihamburkan oleh partikel-partikel koloid akibatnya kekuatan cahaya yang
diabsorpsi berkurang dari yang seharusnya.
9. Penggunaan spektrofotometri UV-Vis dalam metode analisis
Spektrofotometri UV-Vis dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dan kualitatif suatu senyawa. Analisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-
Vis dapat digolongkan menjadi tiga macam Mulja dan Suharman, 1995 yaitu: PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
a. analisis kuantitatif zat tunggal analisis satu komponen b. analisis kuantitatif campuran dua macam zat analisis dua komponen
c. analisis kuantitatif campuran tiga macam zat atau lebih analisis multi komponen.
Analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis hanya dipakai untuk data sekunder atau data pendukung. Pada analisis kualitatif dengan metode
spektrofotometri UV-Vis yang dapat ditentukan ada dua yaitu: a. pemeriksaan kemurnian spektrum UV-Vis
b. penentuan panjang gelombang serapan maksimum. Mulja dan Suharman, 1995
E. Pengembangan Metode Spektrofotometri
Salah satu bentuk pengembangan metode spektrofotometri adalah dengan reaksi pembentukan warna. Reaksi tersebut umumnya dilakukan dengan
memodifikasi kromofor dari suatu molekul sehingga dapat dideteksi di daerah visibel Fell, 1986. Kadarnya kemudian ditetapkan dengan membandingkan serapannya
dengan kurva baku yang dibuat menggunakan baku pembanding Rooth dan Blaschke, 1994.
Keuntungan utama reaksi pembentukan warna adalah bahwa metode ini dapat menambah sensitivitas dan selektivitas spektroskopi absorpsi Fell, 1986.
Kriteria untuk reaksi pembentukan warna yang baik adalah sebagai berikut Vogel, 1978:
1. kespesifikan reaksi warna PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Sangat sedikit reaksi yang spesifik untuk zat-zat tertentu. Oleh karena itu, harus diupayakan agar reaksi yang terjadi spesifik untuk zat tertentu. Caranya antara
lain mereaksikan zat dengan reagen yang spesifik, mengubah kondisi percobaan, dan mengendalikan pH.
2. kesebandingan antara warna dan konsentrasi Intensitas warna larutan hendaknya meningkat secara linier dengan naiknya
konsentrasi zat yang akan ditetapkan. 3. kestabilan warna
Warna yang dihasilkan hendaknya cukup stabil dalam waktu tertentu untuk memungkinkan pembacaan yang tepat.
4. reprodusibilitas Hasil yang didapat harus dapat diulang jika dilakukan pada kondisi yang
sama. 5. kejernihan larutan
Larutan harus bebas dari endapan agar tidak menghamburkan ataupun menyerap cahaya.
6. kepekaan tinggi Diharapkan reaksi warna sangat peka bahkan untuk zat dalam jumlah kecil.
F. Validasi, Kesalahan, dan Parameter Metode Analisis
1. Validasi metode analisis
Validasi metode analisis diartikan sebagai suatu prosedur yang digunakan untuk membuktikan apakah suatu metode analisis memenuhi persyaratan yang
ditentukan Anonim, 2005.
Pedoman-pedoman validasi metode analisis didukung oleh parameter- parameter sebagai berikut :
a. ketepatan. Ketepatan accuracy berarti kedekatan hasil analisis yang
diperoleh dengan menggunakan metode tersebut terhadap nilai sebenarnya. Accuracy dinyatakan dengan persen perolehan kembali recovery dari penambahan zat yang
diketahui kadarnya Anonim, 2005. Untuk kadar analit ≥ 10 biasanya disepakati
perolehan kembali harus masuk dalam rentang 98-102 Yuwono dan Indrayanto, 2005.
b. ketelitian. Ketelitian precision berarti ukuran kedekatan masing-
masing hasil analisis dari beberapa pengukuran di bawah kondisi analisis yang sama. Ketelitian biasanya dinyatakan dengan standar deviasi atau relatif standar deviasi
koefisien variasi Anonim, 2005. Presisi dapat dibedakan menjadi tiga, yaitu Anonim, 2005:
1. repeatability adalah presisi yang dihasilkan dari pengujian suatu metode yang dilakukan oleh individu yang sama dengan menggunakan prosedur yang sama
dan dikerjakan dalam waktu yang singkat. 2. intermediate precission adalah presisi yang dihasilkan dari pengujian suatu
metode yang dilakukan oleh individu yang berbeda dengan menggunakan prosedur dan instrumen yang sama.
3. reproducibility adalah presisi yang dihasilkan dari pengujian suatu metode analisis yang dikerjakan pada laboratorium yang berbeda.
Untuk kadar analit ≥ 10 biasanya disepakati koefisien variasi tidak boleh
lebih dari 2,7 Yuwono dan Indrayanto, 2005. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
c. limit of detection LOD. Limit of Detection adalah kadar terkecil
analit yang dapat terdeteksi tetapi tidak perlu secara kuantitatif. Penentuan LOD dilakukan dengan cara membandingkan respon pengukuran analit dengan blangko.
Rasio signal-to-noise yang diterima untuk LOD adalah 2:1 atau 3:1 Anonim, 2005. d.
limit of quantitation LOQ. Limit of Quantitation adalah konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang dapat diukur dengan ketelitian dan ketepatan yang
diterima di bawah kondisi percobaan yang ditetapkan metode tersebut. Rasio signal- to-noise yang diterima untuk LOQ adalah 10:1 Anonim, 2005.
e. spesifisitas. Spesifisitas merupakan kemampuan pengukuran analit
secara akurat dan spesifik dengan kehadiran komponen lain zat aktif, eksipien, pengotor, dan produk degradasi dalam matriks sampel Anonim, 2005.
f. linearity. Linearity adalah kemampuan suatu metode analisis untuk
secara langsung atau melalui perhitungan matematika mendapatkan hasil uji yang sebanding dengan kadar analit dalam sampel Anonim, 2005.
g. range. Range suatu metode analisis diartikan sebagai interval antara
kadar terendah sampai tertinggi analit yang dapat diukur secara kuantitatif menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan ketelitian dan ketepatan,
dan linearitas yang mencukupi Anonim, 2005.
2. Kesalahan metode analisis
Ada dua macam kesalahan pada analisis kimia menurut Mulja dan Suharman 1995 yaitu:
a. Kesalahan sistematik. Kesalahan ini merupakan hasil analisis yang menyimpang secara tetap dari nilai sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur
analisis. Kesalahan sistematik ini dapat diketahui sebabnya sehingga dapat dikendalikan oleh peneliti. Beberapa cara untuk memperkecil kesalahan ini antara
lain dengan melakukan kalibrasi instrumen secara berkala, pemilihan metode dan prosedur standar dari badan resmi, pemakaian bahan kimia dengan derajat untuk
analisis, serta peningkatan pengetahuan dari peneliti yang bekerja di laboratorium analisis.
b. Kesalahan tidak sistematik. Kesalahan ini disebut juga penyimpangan tidak tetap dari hasil penentuan kadar menggunakan instrumen yang disebabkan
fluktuasi dari instrumen yang dipakai derau. Penyebab kesalahan ini tidak diketahui. Salah satu cara untuk mengatasi kesalahan ini adalah dengan
menggunakan instrumen dengan kualitas yang baik.
3. Parameter-parameter validasi metode analisis
Uji yang paling umum dan prosedur pengukuran dapat dibagi menjadi empat kategori, yaitu Anonim, 2005:
a. Kategori I. Kategori ini meliputi metode analisis untuk kuantifikasi komponen terbesar dalam obat atau zat aktif termasuk pengawet dalam sediaan.
