Analisis Respon Kapasitas Antioksidan

29

C. ANALISIS RESPON DENGAN PROGRAM DESIGN EXPERT 7.0

® Hasil pengukuran dan perhitungan masing-masing respon dari setiap formula minuman selanjutnya dijadikan sebagai input data di dalam program Design Expert 7.0 ® . Hasil input data dari masing-masing respon formula tersebut selanjutnya dianalisa oleh program Design Expert 7.0 ® yang dinamakan sebagai tahap analisis respon. Pada tahap analisis respon, program Design Expert 7.0 ® memberikan beberapa model polinomial yang disesuaikan dengan hasil pengukuran setiap respon. Program Design Expert 7.0 ® memberikan empat pilihan model polinomial untuk setiap respon, yaitu mean, linear, quadratic, dan cubic. Model polinomial merupakan output dari proses analisis respon formula minuman dengan rancangan D-optimal design. Program Design Expert 7.0 ® akan merekomendasikan salah satu model yang paling sesuai untuk setiap respon. Model yang paling sesuai dengan respon akan ditampilkan pada fit summary. Program Design Expert 7.0 ® memberikan fasilitas analisis ragam ANOVA untuk menunjukkan signifikansi dari model yang direkomendasikan. Selanjutnya, model yang direkomendasikan tersebut ditampilkan di dalam suatu contour plot, yang berupa gambar dan grafik dua dimensi 2-D atau tiga dimensi 3-D. Model yang baik adalah model yang signifikan terhadap respon, memberikan lack of fit yang tidak signifikan, memiliki nilai predicted R-squared dan adjusted R-squared yang saling mendukung, serta memberikan nilai adequate precision lebih dari 4. Model yang baik akan memberikan prediksi yang baik bagi rata-rata keluaran yang dihasilkan. Pada tahap analisis respon, program Design Expert 7.0 ® juga memberikan fasilitas plot kenormalan residual normal plot residual yang mengindikasikan apakah residual selisih antara respon aktual dengan nilai respon yang diprediksikan mengikuti garis kenormalan garis lurus. Titik-titik data yang semakin mendekati garis kenormalan menunjukkan titik-titik data yang menyebar normal yang berarti hasil aktual akan mendekati hasil yang diprediksikan oleh program Design Expert 7.0 ® . Pada plot kenormalan residual terdapat nilai internally studentized residual pada sumbu x, yaitu besarnya standar deviasi yang memisahkan nilai respon aktual dengan yang diprediksikan dan nilai normal probability, yaitu persentase kemungkinan data hasil respon menyebar normal Cornell 1999.

1. Analisis Respon Kapasitas Antioksidan

Senyawa fitokimia dalam tanaman telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan, tetapi keberadaan masing-masing komponen tersebut dalam jaringan tanaman relatif sulit untuk diukur secara terpisah Pratt 1992. Oleh karena itu, beberapa metode telah dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir untuk menghitung total aktivitas antioksidan sampel. Metode penangkapan senyawa radikal bebas stabil DPPH dipilih karena metode ini dapat mengukur kapasitas antioksidan semua jenis substrat dalam sampel, baik substrat yang bersifat hidrofilik maupun lipofilik sehingga diharapkan dapat menghasilkan hasil pengukuran yang lebih baik dibandingkan metode pengukuran aktivitas antioksidan lainnya Vankar et al. 2002. Pengukuran kapasitas antioksidan dalam penelitian ini dilakukan dengan metode penangkapan radikal bebas stabil DPPH. DPPH adalah suatu radikal bebas stabil yang dapat bereaksi dengan radikal lain membentuk suatu senyawa yang stabil. Selain itu, DPPH juga dapat bereaksi dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan membentuk DPPH tereduksi DPP Hidrazin yang stabil Molyneux 2004. Pengujian kapasitas antioksidan 30 dengan menggunakan DPPH tidak spesifik menguji suatu komponen antioksidan, tetapi digunakan untuk pengukuran kapasitas antioksidan total dalam bahan pangan. Pengukuran kapasitas antioksidan dengan metode DPPH menggunakan prinsip spektrofotometri. Senyawa DPPH dalam metanol yang berwarna ungu tua deep violet dapat terdeteksi pada panjang gelombang sinar tampak sekitar 520nm. Menurut Molyneux 2004, suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya untuk berikatan dengan DPPH membentuk DPP Hidrazin, ditandai dengan semakin hilangnya warna ungu menjadi kuning pucat. Asam askorbat digunakan sebagai standar pengukuran kapasitas antioksidan dalam penelitian ini. Kemampuan asam askorbat dalam berbagai konsentrasi untuk menangkap radikal bebas stabil DPPH dipetakan dalam kurva standar asam askorbat. Persamaan regresi yang didapatkan dari kurva standar tersebut kemudian digunakan untuk mengetahui kapasitas antioksidan sampel formula minuman yang disetarakan dengan kapasitas antioksidan asam askorbat donor atom hidrogen dalam menangkap radikal bebas stabil DPPH. Kapasitas antioksidan formula minuman yang diukur dinyatakan dalam AEAC Ascorbic Acid Equivalent Antioxidant Capacity dengan satuan mgAEqml. Nilai yang diperoleh menunjukkan jumlah μg asam askorbat yang ekivalen dengan 1 ml sampel. Hasil uji respon kapasitas antioksidan berkisar antara 0.0843mgAEqml hingga 0.1775mgAEqml. Nilai kapasitas antioksidan terendah yaitu 0.0843mgAEqml berasal dari formula 7 yang hanya mengandung ekstrak asam jawa, sedangkan nilai kapasitas antioksidan tertinggi sebesar 0.1775mgAEqml berasal dari formula 8 yang mengandung campuran dari ketiga ekstrak rempah yang digunakan ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, dan ekstrak jahe. Nilai rata-rata mean dari respon kapasitas antioksidan adalah 0.14mgAEqml dengan standar deviasi sebesar 6.7120x10 -3 mgAEqml. Kapasitas antioksidan yang dihasilkan sangat dipengaruhi oleh kandungan senyawa aktif dari ekstrak rempah yang digunakan. Kunyit memiliki aktivitas antioksidan yang cukup tinggi dan senyawa kurkumin merupakan komponen utama yang menyebabkan aktivitas antioksidan tersebut Chang, Fong 1994. Asam jawa banyak mengandung asam tartarat, asam malat, asam oksalat, dan asam askorbat. Aktivitas antioksidan asam jawa diduga berasal dari asam askorbat. Sebagian besar kandungan asam pada asam jawa adalah asam tartarat. Sebaliknya, kandungan asam askorbat pada asam jawa sangat rendah sehingga kapasitas antioksidan asam jawa pun rendah Nagy, Shaw 1980. Jahe banyak mengandung zat antioksidan alami seperti gingerol dan zingeron Nabet 1996. Aktivitas antioksidan dari 6- gingerol, 6-shogaol, san 6-gingerdiol yang terkandung dalam jahe dinyatakan lebih tinggi daripada α-tocopherol Kikuzaki, Nakatani 1993. Berdasarkan analisis yang dilakukan, model polinomial dari kapasitas antioksidan adalah reduced cubic. Model polinomial yang direkomendasikan oleh program Design Expert 7.0 ® adalah cubic, tetapi model ini memberikan nilai predicted R-squared yang negatif, sehingga dilakukan reduksi model dengan cara backward elimination. Reduksi model yang dilakukan menghilangkan interaksi komponen AC ekstrak kunyit dan ekstrak jahe dan ABC ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, dan ekstrak jahe. Selain kedua interaksi antar komponen tersebut, interaksi komponen ACA-C yang merupakan interaksi antara ekstrak kunyit, ekstrak jahe, dan selisihnya serta ABA-B yang merupakan interaksi antara ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, dan selisihnya juga tidak diikutkan dalam model karena dianggap tidak signifikan tidak memenuhi α out =0.1000. 31 Hasil analisis ragam ANOVA menunjukkan bahwa model yang telah direduksi reduced cubic signifikan dengan nilai p “probF” lebih kecil dari 0.05 0.0001. Selain itu, dapat diketahui secara terpisah linear mixture komponen A ekstrak kunyit, B ekstrak asam jawa, dan C ekstrak jahe memberikan pengaruh yang nyata terhadap respon kapasitas antioksidan. Selain ketiga komponen tersebut, interaksi komponen AB ekstrak kunyit dan ekstrak asam jawa dan BC ekstrak asam jawa dan ekstrak jahe juga memberikan pengaruh yang nyata terhadap kapasitas antioksidan. Selain interaksi antar komponen tersebut, interaksi komponen BCB-C yang merupakan interaksi antara ekstrak asam jawa, ekstrak jahe, dan selisih keduanya juga memberikan pengaruh yang nyata terhadap respon kapasitas antioksidan. Lack of fit F-value adalah sebesar 1.14 dengan nilai p “ProbF” lebih besar dari 0.05 0.6144 yang menunjukkan bahwa Lack of fit tidak signifikan relatif terhadap pure error. Nilai lack of fit yang tidak signifikan adalah syarat untuk model yang baik. Nilai lack of fit yang tidak signifikan ini menunjukkan adanya kesesuaian data respon kapasitas antioksidan dengan model. Besarnya nilai predicted R-squared dan adjusted R-squared untuk respon kapasitas antioksidan secara berturut-turut adalah 0.9116 dan 0.9449 yang menunjukkan bahwa data- data yang diprediksikan dan data-data aktual untuk respon kapasitas antioksidan tercakup ke dalam model sebesar 91.16 dan 94.49. Nilai predicted R-squared yang dihasilkan mendukung nilai adjusted R-Squared yang dihasilkan karena selisih keduanya lebih kecil dari 0.2. Adequate precision untuk respon kapasitas antioksidan adalah 23.440 yang menunjukkan besarnya sinyal terhadap noise ratio. Nilai adequate precision yang lebih besar dari 4 23.440 mengindikasikan sinyal yang memadai sehingga model ini dapat digunakan sebagai pedoman design space. Berdasarkan analisis yang telah dilakukan, model yang dihasilkan memenuhi syarat sebagai model yang baik sehingga diharapkan dapat memberikan prediksi yang baik. Persamaan polinomial untuk respon kapasitas antioksidan adalah sebagai berikut: Kapasitas Antioksidan = 4.4640x10 -3 A + 2.8881x10 -3 B + 3.8750x10 -3 C + 2.7328x10 -4 AB + 2.5457x10 -4 BC – 2.0316x10 -5 BCB-C Keterangan: A = ekstrak kunyit B = ekstrak asam jawa C = ekstrak jahe Berdasarkan persamaan tersebut terlihat bahwa selain dipengaruhi oleh tiga komponen ekstrak rempah ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, dan ekstrak jahe, kapasitas antioksidan juga dipengaruhi oleh interaksi di antara ketiga komponen tersebut. Respon kapasitas antioksidan akan meningkat seiring peningkatan jumlah ekstrak kunyit, ekstrak asam jawa, ekstrak jahe, interaksi antara ekstrak kunyit dan ekstrak asam jawa, serta interaksi antara ekstrak asam jawa dan ekstrak jahe. Hal ini ditunjukkan dengan konstanta yang bernilai positif. Respon kapasitas antioksidan akan mengalami penurunan seiring dengan peningkatan interaksi antara ekstrak asam jawa, ekstrak jahe, dan selisih keduanya. Hal ini ditunjukkan dengan konstanta yang bernilai negatif. Peningkatan respon kapasitas antioksidan sangat dipengaruhi oleh penambahan ekstrak kunyit karena nilai konstanta dari komponen ini paling besar 4.4640x10 -3 , diikuti dengan penambahan ekstrak jahe 3.8750x10 -3 , penambahan ekstrak asam jawa 2.8881x10 -3 , 32 interaksi ekstrak kunyit dan asam jawa 2.7328x10 -4 , serta interaksi ekstrak asam jawa dan ekstrak jahe 2.5457x10 -4 . Grafik kenormalan internally studentized residual untuk respon kapasitas antioksidan dapat dilihat pada Gambar 10. Grafik contour plot untuk respon kapasitas antioksidan dapat dilihat pada Gambar 11, sedangkan grafik tiga dimensinya dapat dilihat pada Gambar 12. Berdasarkan Gambar 10 terlihat bahwa titik-titik berada dekat di sepanjang garis normal, sehingga dapat dikatakan bahwa data-data untuk respon kapasitas antioksidan menyebar normal. Data-data respon kapasitas antioksidan yang menyebar normal menunjukkan adanya pemenuhan model terhadap asumsi dari ANOVA pada respon kapasitas antioksidan. Gambar 10. Grafik kenormalan internally studentized residuals respon kapasitas antioksidan Gambar 11. Grafik countour plot hasil uji respon kapasitas antioksidan Design-Expert® Software Kapasitas Antioksidan Color points by value of Kapasitas Antioksidan: 0.1775 0.0843 N o rm a l P ro b a b ili ty Normal Plot of Residuals -3.00 -2.00 -1.00 0.00 1.00 2.00 1 5 10 20 30 50 70 80 90 95 99 Design-Expert® Software Kapasitas Antioksidan Design Points 0.1775 0.0843 X1 = A: Kunyit X2 = B: Asam X3 = C: Jahe A: Kunyit 30 B: Asam 30 C: Jahe 30 0.0925 0.1147 0.1368 0.1368 0.1590 0.1590 0.1811 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 33 Grafik countour plot pada Gambar 11 menggambarkan bagaimana kombinasi antar komponen saling mempengaruhi nilai respon kapasitas antioksidan. Warna-warna yang berbeda pada grafik contour plot menunjukkan nilai respon kapasitas antioksidan. Warna biru menunjukkan nilai respon kapasitas antioksidan terendah, yaitu 0.0843mgAEqml. Warna merah menunjukkan respon kapasitas antioksidan tertinggi, yaitu 0.1775mgAEqml. Garis- garis yang terdiri atas titik-titik pada grafik contour plot menunjukkan kombinasi dari ketiga komponen dengan jumlah berbeda yang menghasilkan respon kapasitas antioksidan yang sama. Bentuk permukaan dari hubungan interaksi antar komponen ini dapat dilihat lebih jelas pada grafik tiga dimensi yang ditunjukkan pada Gambar 12. Perbedaan ketinggian permukaan menunjukkan nilai respon yang berbeda-beda pada setiap kombinasi antar komponen formula. Area yang rendah menunjukkan nilai respon kapasitas antioksidan yang rendah sedangkan area yang tinggi menunjukkan nilai respon kapasitas antioksidan yang tinggi. Gambar 12. Grafik tiga dimensi hasil uji respon kapasitas antioksidan

2. Analisis Respon pH