UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
disterilisasi, semua alat dan bahan disimpan dalam Laminar Air Flow yang sebelumnya sudah disterilisasi dengan lampu UV selama 30 menit dan
dibersihkan dengan alkohol 70 Staf Pengajar FKUI, 1994. Untuk membuat agar miring, NA yang telah disterilkan dituang pada suhu
60 – 50
o
C ke dalam tabung reaksi yang telah disterilkan sebanyak 5 mL, kemudian disumbat dengan kapas steril dan diposisikan miring sekitar 45
o
kemudian ditunggu sampai mengeras.
b. Peremajaan Bakteri
Disiapkan agar miring NA steril, lalu diambil stok bakteri Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan Escherichia coli ATCC 35218 dengan menggunakan ose
steril yang telah dipijarkan lalu ditanam pada permukaan agar miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C Valgas et al, 2007.
c. Pembuatan Suspensi Bakteri
Stok bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang telah diremajakan pada medium NA miring, diambil 1 ose lalu disuspensikan ke dalam
9 mL NaCl fisiologis 0,9 steril. Kekeruhan suspensi dibandingkan dengan standar McFarland III 10
9
CFUmL. Kemudian diencerkan dengan kaldu BHI sampai 10
6
CFUmL Valgas et al, 2007.
d. Uji Bioautografi Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
Fraksi hasil kromatografi kolom yang telah digabungkan berdasarkan nilai Rf, dilarutkan dengan pelarut yang sesuai hingga konsentrasi menjadi 50 mgmL.
Larutan fraksi sebanyak 10 µL ditotolkan pada plat KLT berukuran 6,5 x 7 cm kemudian dikering anginkan untuk menghilangkan pelarutnya. Suspensi bakteri
10
6
CFUmL dituang dalam cawan petri steril. Plat KLT yang telah ditotolkan larutan fraksi sebanyak 10 µL, dicelupkan dalam campuran BHI dan suspensi
bakteri dalam cawan petri sebanyak 10 mL selama 5 detik. Selanjutnya plat KLT disimpan dalam cawan petri lainnya yang telah diberi kapas yang dibasahi dengan
aquadest yang telah disterilkan. Plat diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium INT
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
konsentrasi 2 mgmL dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C Ismail et al, 2011 ; Valgas et al, 2007.
Untuk mengetahui nilai Rf senyawa aktif antibakteri maka dilakukan uji bioautografi elusi pada fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri dengan spot
paling sedikit, dilihat dari profil KLT. Fraksi tersebut dilarutkan dengan metanol sehingga diperoleh larutan fraksi dengan konsentrasi 50 mgmL. Larutan fraksi
sebanyak 10 µL ditotolkan pada plat KLT, kemudian dielusi menggunakan fase gerak n-heksana : etil asetat 4:6. Setelah larutan fraksi dielusi, plat KLT
dicelupkan dalam campuran BHI dan suspensi bakteri dalam cawan petri sebanyak 10 mL selama 5 detik. Selanjutnya plat KLT disimpan dalam cawan
petri lainnya yang telah diberi kapas yang dibasahi dengan aquadest yang telah disterilkan. Plat diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium INT konsentrasi 2 mgmL
dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C.
3.3.8. Uji Kemurnian Senyawa a. KLT dua dimensi
Plat KLT dibuat dengan bentuk bujur sangkar yang setiap sisinya memiliki ukuran 5 cm. Kemudian isolat dilarutkan dengan etil asetat dan ditotolkan pada
salah satu sisi plat dengan pipa kapiler, selanjutnya plat KLT dielusi dengan fase gerak n-heksana : etil asetat 8:2 dan dibiarkan kering sesaat Pramita, 2013. Plat
KLT dielusi kembali pada sisi lainnya dengan menggunakan fase gerak yang sama. Noda yang timbul dilihat dibawah lampu UV 254 nm. Jika kromatogram
menunjukkan satu pola noda, maka dapat dikatakan isolat tersebut relatif murni.
b. Uji Titik Leleh
Sampel dibuat dengan memasukkan kristal ke ujung pipa kapiler yang telah ditutup salah satu ujungnya, kemudian diketuk-ketuk hingga kristal mampat.
Selanjutnya pipa kapiler dimasukkan ke alat pengukur melting point. Kemudian dilakukan pengamatan rentang suhu ketika kristal mulai melebur dari awal
melebur hingga melebur sempurna.
