UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
a.4 b.4
Gambar 4.4.
Hasil uji bioautografi fraksi dari ekstrak etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
Keterangan : a.1 Hasil pengujian fraksi 1-10 terhadap bakteri Staphylococcus aureus
a.2 Hasil pengujian fraksi 10-20 terhadap bakteri Staphylococcus aureus a.3 Hasil pengujian fraksi 21-25 terhadap bakteri Staphylococcus aureus
a.4 Hasil pengujian kloramfenikol terhadap bakteri Staphylococcus aureus b.1 Hasil pengujian fraksi 1-10 terhadap bakteri Escherichia coli
b.2 Hasil pengujian fraksi 10-20 terhadap bakteri Escherichia coli b.3 Hasil pengujian fraksi 21-25 terhadap bakteri Escherichia coli
b.4 Hasil pengujian kloramfenikol terhadap bakteri Escherichia coli Gambar diatas menunjukkan bahwa dari 25 fraksi ekstrak etil asetat,
terdapat 21 fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, 2 fraksi yang memiliki aktivitas
antibakteri terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus, dan 2 fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan Escherichia coli. Fraksi hasil
fraksinasi memiliki kepekaan yang berbeda-beda terhadap kedua bakteri uji. Fraksi 1 dan 2 tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri
S.aureus, sedangkan fraksi 6 dan 8 tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri E.coli. Hal ini terjadi diduga karena perbedaan kemampuan
senyawa yang terkandung dalam fraksi untuk berdifusi ke dalam sel bakteri dan menimbulkan penghambatan Rifda, dkk. 2005.
K + K +
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut fraksi yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol. Natheer et al 2012 menyebutkan bahwa zat yang dijadikan
sebagai konrol negatif adalah pelarut yang digunakan sebagai pelarut uji. Tujuannya adalah sebagai pembanding bahwa pelarut yang digunakan tidak
mempengaruhi hasil uji antibakteri fraksi. Hasil uji bioautografi menunjukkan bahwa tidak adanya zona hambat yang terbentuk pada kontrol negatif. Hal ini
mengindikasikan bahwa pelarut yang digunakan tidak berpengaruh terhadap aktivitas antibakteri fraksi.
Kontrol positif yang digunakan adalah kloramfenikol 200 ppm.
Kloramfenikol dipilih karena merupakan antibiotik berspektrum luas yang dapat menghambat atau membunuh bakteri dari golongan Gram positif maupun Gram
negatif. Kloramfenikol memberikan efek dengan cara bereaksi pada sub unit 50S ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase. Enzim ini berfungsi
untuk membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang masih melekat pada tRNA dengan asam amino terakhir yang sedang berkembang. Sebagai
akibatnya, sintesis protein bakteri akan terhenti seketika dan menyebabkan bakteri mati Pratiwi, 2008.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa mayoritas penghambatan bakteri dengan zona hambat yang luas ditunjukkan oleh fraksi-fraksi yang bersifat
semipolar. Menurut Kanazawa et al 1995, suatu senyawa yang mempunyai polaritas optimum akan mempunyai aktivitas antibakteri maksimum, karena untuk
interaksi suatu senyawa antibakteri dengan bakteri diperlukan keseimbangan hidrofilik dan lipofilik. Sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa larut
dalam fase air yang merupakan tempat hidup bakteri, tetapi senyawa yang bekerja pada membran sel hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik sehingga senyawa
antibakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik dan lipofilik untuk mencapai aktivitas yang optimal.
Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa rata-rata zona hambat yang terbentuk pada E.coli Gram negatif lebih kecil dibandingkan dengan S.aureus.
Hal ini menunjukkan bahwa E.coli lebih tahan terhadap senyawa antibakteri
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dibandingkan S.aureus. Hal ini sesuai dengan pernyataan Zuhud et al. 2001 bahwa bakteri Gram negatif mempunyai ketahanan yang lebih baik terhadap
senyawa antimikroba dibandingkan bakteri Gram positif. Perbedaan ketahanan hambatan mungkin dikarenakan perbedaan susunan dinding sel bakteri dimana
E.coli mempunyai lapisan dinding sel yang lebih kompleks dibandingkan S.aureus Natheer et al, 2012.
Berdasarkan hasil profil KLT fraksi, fraksi 9 memiliki spot paling sedikit diantara fraksi lainnya dan berdasarkan hasil uji bioautografi fraksi 9 memiliki
aktivitas antibakteri dengan diameter zona hambat sebesar 8,6 mm terhadap Staphylococcus aureus dan 5,6 mm terhadap Escherichia coli, sehingga fraksi 9
dipilih untuk dilakukan pemurnian lebih lanjut.
4.8. Pemurnian dan Uji Kemurnian Fraksi 9
Pemurnian fraksi 9 dilakukan dengan cara rekristalisasi, yaitu berdasarkan perbedaan kelarutan antara zat utama yang dimurnikan dengan senyawa minor
dalam suatu pelarut tunggal atau campuran pelarut yang cocok. Fraksi 9 yang berbentuk kristal dibersihkan dari pengotornya dengan menambahkan n-heksan
untuk menarik pengotor yang bersifat nonpolar, karena berdasarkan profil KLT fraksi 9 menunjukkan adanya pengotor diatas spot. Proses rekristalisasi ini
diulang sehingga didapatkan senyawa berbentuk kristal yang lebih murni yang diuji kemurniannya menggunakan KLT 2 Dimensi.
Gambar 4.5. Profil KLT fraksi 9 sebelum rekristalisasi di bawah UV 254 nm
pengotor
NH:E 4:6
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Uji kemurnian senyawa dengan KLT dua dimensi dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak dalam metanol dan ditotolkan pada plat KLT berbentuk bujur
sangkar dengan sisi 5 cm. Plat KLT dielusi dengan fase gerak n-heksan : etil asetat = 4 : 6 dan dibiarkan sesaat. Kemudian plat dielusi kembali pada sisi
lainnya menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat = 8 : 2. Hasil uji kemurnian dari KLT dua dimensi menunjukkan adanya spot mayor dengan sedikit pengotor
pada Rf 0,7.
Gambar 4.6. Profil KLT 2 dimensi fraksi 9 setelah rekristalisasi di bawah UV
254 nm
4.9. Uji Bioautografi Elusi Fraksi 9
Fraksi 9 kemudian diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi elusi. Fraksi 9 dengan konsentrasi 20 mgmL ditotolkan pada plat
KLT sebanyak 10 µL dan dielusi menggunakan eluen n-heksan : etil asetat = 4 : 6. Eluen dipilih karena memberikan pola pemisahan yang baik. Plat kemudian
dicelupkan ke dalam suspensi bakteri selama 5 detik dan dipindahkan pada cawan steril lain yang berisi kapas yang telah dibasahi. Plat kemudian diinkubasi selama
24 jam pada suhu 36
o
C ± 1
o
C. Plat divisualisasikan dengan penyemprotan INT.
NH:E 4:6
1
N H
:E 8
:2
2
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
a b
Gambar 4.7. Hasil uji bioautografi elusi fraksi 9 terhadap Staphylococcus aureus
a dan Escherichia coli b. Berdasarkan hasil bioautografi elusi, fraksi 9 menunjukkan adanya
beberapa spot. Hal ini menunjukkan bahwa fraksi 9 belum murni. Perbedaan hasil profil KLT dengan hasil uji bioautografi terjadi diduga karena adanya perbedaan
konsentrasi fraksi yang ditotolkan pada plat KLT. Fraksi 9 dengan nilai Rf 0,7 memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia
coli yang ditandai dengan adanya zona bening diatas spot dan tidak adanya bakteri yang tumbuh pada spot senyawa. Tetapi penghambatan yang ditunjukan oleh
fraksi 9 sangat kecil, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap fraksi-fraksi lain yang memiliki daya hambat yang besar pada uji bioautografi non
elusi seperti fraksi 13. Fraksi 9 tidak dilakukan pemurniaan lebih lanjut dikarenakan jumlah fraksi tidak mencukupi.
Dari pengujian antibakteri yang dilakukan terhadap fraksi-fraksi hasil fraksinasi dari ekstrak etil asetat buah parijoto dengan kromatografi kolom
diperoleh hasil bahwa dari 25 fraksi, terdapat 21 fraksi aktif antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, 2 fraksi aktif antibakteri terhadap
Staphylococcus aureus, dan 2 fraksi aktif antibakteri terhadap Escherichia coli. Diagram hasil uji bioautografi terhadap 25 fraksi ditunjukkan pada gambar 4.8.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.8. Diagram hasil uji bioautografi 25 fraksi terhadap S.aureus dan
E.coli Keterangan :
A : Jumlah fraksi yang aktif terhadap bakteri S.aureus B : Jumlah fraksi yang aktif terhadap bakteri S.aureus dan E.coli
C : Jumlah fraksi yang aktif terhadap bakteri E.coli Adanya penghambatan bakteri yang ditunjukkan oleh fraksi diduga terjadi
karena adanya kandungan metabolit sekunder pada ekstrak etil asetat yang dilihat dari hasil uji fitokimia ekstrak. Metabolit sekunder yang terkandung dalam
ekstrak adalah tanin, flavonoid, dan saponin dimana diketahui bahwa ketiga metabolit sekunder ini telah dilaporkan memiliki peran penting dalam aktivitas
penghambatan bakteri. Tanin sebagai antibakteri bekerja dengan cara menghambat enzim reverse
transkriptase dan DNA topoisomerase sehingga sel bakteri tidak dapat terbentuk. Tannin memiliki aktifitas antibakteri yang berhubungan dengan kemampuannya
untuk menginaktifkan adhesin sel bakteri juga menginaktifkan enzim, dan menggangu transport protein pada lapisan dalam sel. Tanin juga mempunyai
target pada polipeptida dinding sel sehingga pembentukan dinding sel menjadi kurang sempurna. Hal ini menyebabkan sel bakteri menjadi lisis karena tekanan
osmotik maupun fisik sehingga sel bakteri akan mati. Selain itu, kompleksasi dari ion besi dengan tanin dapat menjelaskan toksisitas tanin. Bakteri yang tumbuh
di bawah kondisi aerobik membutuhkan zat besi untuk berbagai fungsi, termasuk reduksi dari prekursor ribonukleotida DNA. Hal ini disebabkan oleh kapasitas
pengikat besi yang kuat oleh tanin Ngajow, dkk. 2013. Flavonoid sebagai antibakteri bekerja dengan cara membentuk senyawa
kompleks dengan protein ekstraseluler dan terlarut sehingga dapat merusak
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
membrane sel bakteri dan diikuti dengan keluarnya senyawa intraseluler. Selain berperan dalam inhibisi pada sintesis DNA – RNA dengan interkalasi atau ikatan
hidrogen dengan penumpukan basa asam nukleat, flavonoid juga berperan dalam menghambat metabolisme energi yang dibutuhkan untuk penyerapan aktif
berbagai metabolit dan untuk biosintesis makromolekul Ngajow, dkk. 2013. Saponin sebagai antibakteri bekerja dengan cara menurunkan tegangan
permukaan sehingga mengakibatkan naiknya permeabilitas atau kebocoran sel dan mengakibatkan senyawa intraseluler akan keluar. Senyawa ini berdifusi melalui
membran luar dan dinding sel yang rentan, lalu mengikat membran sitoplasma dan mengganggu dan mengurangi kestabilan sel. Hal ini menyebabkan sitoplasma
bocor keluar dari sel yang mengakibatkan kematian sel Ngajow, dkk. 2013. Data diatas menunjukkan bahwa fraksi-fraksi dari ekstrak etil asetat buah
parijoto berpotensi menghasilkan senyawa antibakteri, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan senyawa aktif antibakteri.
