UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.6. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram digunakan untuk identifikasi anggota dari domain bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diambil masing-masing 1 ose dan digores-goreskan pada permukaan kaca objek steril, ditetesi NaCl 0,9 ,
kemudian dilakukan fiksasi. Kristal violet sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek yang terdapat lapisan bakteri tersebut dan didiamkan
selama 1 menit. Setelah 1 menit, kaca objek dibilas dengan air sampai zat warna luntur. Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, larutan lugol
sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, kaca objek dibilas dengan air. Kaca objek dibilas
dengan alkohol 96 sampai semua zat warna luntur kemudian dicuci dengan air. Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, safranin sebanyak 1
tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek dan didiamkan selama 45 detik. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan. Preparat diamati menggunakan
mikroskop dengan perbesaran 100x Pratiwi, 2008.
3.3.7. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi dari Ekstrak Etil Asetat Buah Parijoto
a. Pembuatan Medium serta Sterilisasi Alat dan Bahan
Medium yang digunakan untuk membiakkan bakteri uji adalah medium NA Nutrient Agar. Serbuk NA sebanyak 2,8 gram dicampur dengan 100 mL
aquadest di dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan stirer di atas hotplate hingga larut. Medium yang digunakan untuk membuat
suspensi bakteri adalah BHI Brain Heart Infussion. Serbuk BHI sebanyak 3,7 gram dicampur dengan 100 mL aquadest di dalam erlenmeyer kemudian
dipanaskan dan diaduk menggunakan stirer di atas hotplate hingga larut. Bahan yang telah dibuat disumbat dengan kapas yang telah dibungkus kasa, termasuk
aquadest dan NaCl 0,9. Cawan petri yang telah dibungkus dengan kertas, tabung reaksi yang telah disumbat dengan kapas dilapisi kasa, dan tip dimasukkan ke
dalam plastik tahan panas. Seluruh alat dan bahan yang telah siap disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit. Setelah
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
disterilisasi, semua alat dan bahan disimpan dalam Laminar Air Flow yang sebelumnya sudah disterilisasi dengan lampu UV selama 30 menit dan
dibersihkan dengan alkohol 70 Staf Pengajar FKUI, 1994. Untuk membuat agar miring, NA yang telah disterilkan dituang pada suhu
60 – 50
o
C ke dalam tabung reaksi yang telah disterilkan sebanyak 5 mL, kemudian disumbat dengan kapas steril dan diposisikan miring sekitar 45
o
kemudian ditunggu sampai mengeras.
b. Peremajaan Bakteri
Disiapkan agar miring NA steril, lalu diambil stok bakteri Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan Escherichia coli ATCC 35218 dengan menggunakan ose
steril yang telah dipijarkan lalu ditanam pada permukaan agar miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C Valgas et al, 2007.
c. Pembuatan Suspensi Bakteri
Stok bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang telah diremajakan pada medium NA miring, diambil 1 ose lalu disuspensikan ke dalam
9 mL NaCl fisiologis 0,9 steril. Kekeruhan suspensi dibandingkan dengan standar McFarland III 10
9
CFUmL. Kemudian diencerkan dengan kaldu BHI sampai 10
6
CFUmL Valgas et al, 2007.
d. Uji Bioautografi Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
Fraksi hasil kromatografi kolom yang telah digabungkan berdasarkan nilai Rf, dilarutkan dengan pelarut yang sesuai hingga konsentrasi menjadi 50 mgmL.
Larutan fraksi sebanyak 10 µL ditotolkan pada plat KLT berukuran 6,5 x 7 cm kemudian dikering anginkan untuk menghilangkan pelarutnya. Suspensi bakteri
10
6
CFUmL dituang dalam cawan petri steril. Plat KLT yang telah ditotolkan larutan fraksi sebanyak 10 µL, dicelupkan dalam campuran BHI dan suspensi
bakteri dalam cawan petri sebanyak 10 mL selama 5 detik. Selanjutnya plat KLT disimpan dalam cawan petri lainnya yang telah diberi kapas yang dibasahi dengan
aquadest yang telah disterilkan. Plat diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium INT
Kategori