Isolasi Senyawa Menggunakan Kromatografi Kolom

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta UIN Syarif Hidayatullah Jakarta a b Gambar 4.3. Hasil pewarnaan Gram bakteri Staphylococcus aureus a dan Escherichia coli b di bawah mikroskop perbesaran 100 x 10 Gambar a menunjukkan bahwa bakteri yang dibiakkan pada kultur kerja adalah bakteri S.aureus yang merupakan bakteri Gram positif berbentuk kokus bulat seperti buah anggur. Sedangkan gambar b menunjukkan bahwa bakteri yang dibiakkan pada kultur kerja lainnya adalah bakteri E.coli yang merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil batang. Perbedaan warna yang terjadi disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung peptidlogikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakeri Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram negatif alkohol akan merusak lapisan lipopolisakarida sehingga kompleks kristal violet-iodin dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin Pratiwi, 2008.

b. Penyiapan Media serta Strerilisasi Alat dan Bahan

Media adalah bahan atau campuran bahan yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan bakteri. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah Nutrient Agar NA dan Brain Heart Infussion BHI. Bahan dan alat yang akan digunakan disterilasi terlebih dahulu. Sterilisasi dilakukan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta UIN Syarif Hidayatullah Jakarta untuk membunuh mikroorganisme yang terdapat pada media dan alat sehingga dalam pengerjaan uji tidak terjadi kontaminasi bakteri lain yang tidak diinginkan. Sterilisasi dilakukan menggunakan autoklaf untuk alat-alat yang presisi dan media, sedangkan alat-alat non presisi seperti cawan petri disterilisasi menggunakan oven. Mekanisme autoklaf dalam membunuh bakteri adalah uap panas pada autoklaf akan mendenaturasi dan mengkoagulasi protein pada bakteri sehingga bakteri menjadi mati. Dibandingkan dengan panas lembab autoklaf, panas kering oven kurang efisien dan membutuhkan suhu lebih tinggi serta waktu lebih lama untuk sterilisasi. Hal ini disebabkan karena tanpa kelembapan tidak ada panas laten Cahyani, 2009.

c. Peremajaan Bakteri Uji

Bakteri uji yang akan digunakan dilakukan peremajaan untuk meregenerasi bakteri sehingga diperoleh sel bakteri yang muda. Nutrient Agar NA digunakan sebagai media pembiakan bakteri. Dilakukan penanaman bakteri pada agar miring NA dan kemudian diinkubasi dalam incubator selama 24 jam dengan suhu 37 o C. Tujuan dilakukan inkubasi yaitu untuk mengkondisikan lingkungan pada suhu optimum perkembangan bakteri sehingga dapat diketahui bahwa bakteri berkembang dengan baik Valgas et al, 2007.

d. Pembuatan Suspensi Bakteri

Bakteri uji hasil peremajaan diambil 1 ose lalu disuspensikan ke dalam 9 mL NaCl fisiologis 0,9 steril. Kekeruhan suspensi dibandingkan dengan standar McFarland III 10 9 CFUmL. Kemudian diencerkan dengan kaldu BHI sampai 10 6 CFUmL. Pengujian dilakukan pada jumlah bakteri uji 10 6 CFUmL karena pada jumlah ini bakteri mulai menjadi patogen Valgas et al, 2007.

e. Uji Bioautografi Non-Elusi Fraksi

Pada pengujian non elusi, dibuat larutan dengan konsentrasi 50 mgmL dari setiap fraksi, ditotolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL dan ditunggu hingga pelarut menguap. Konsentrasi ini dipilih berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan oleh Mukarromah 2015 dimana telah dilakukan uji bioautografi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan konsentrasi 1 mgmL, 5 mgmL, 10 mgmL,dan 50 mgmL. Pada tiga konsentrasi awal tidak terlihat zona hambat pertumbuhan bakteri dan pada konsentrasi 50 mgmL menunjukkan zona hambat, sehingga konsentrasi yang dipilih adalah 50 mgmL. Plat yang telat berisi fraksi dicelupkan ke dalam suspensi bakteri selama 5 detik dan dipindahkan pada cawan steril lain yang berisi kapas yang telah dibasahi. Adanya kapas yang telah dibasahi disekitar cawan adalah untuk menjaga udara di dalam cawan tetap lembab. Plat kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 36 o C ± 1 o C Ismail, 2011. Zona hambat yang terbentuk kemudian divisualisasikan dengan menyemprotkan reagen pendeteksi yaitu INT sehingga terjadi reaksi enzimatik antara bakteri dengan INT. Enzim dehidrogenase yang terdapat dalam bakteri akan mengubah INT menjadi formazan yang berwarna ungu. Setelah disemprot, plat dinkubasi kembali selama 4 jam, kemudian diukur zona hambat yang terbentuk menggunakan jangka sorong. Zona hambat komponen aktif antibakteri ditandai dengan terbentuknya daerah putih pada plat yang berlatar ungu Hamburger, et al. 1987. Hasil pengujian aktivitas antibakteri seluruh fraksi terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dapat dilihat pada tabel 4.3. Tabel 4.3. Hasil uji bioautografi fraksi dari ekstrak etil asetat terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli Fraksi Diameter Zona Hambat S. aureus E.coli 1 - 5,9 mm 2 - 4,4 mm 3 5,3 mm 6,2 mm 4 8,4 mm 4,7 mm 5 7,9 mm 5,9 mm 6 8,0 mm - 7 14,3 mm 3,8 mm UIN Syarif Hidayatullah Jakarta UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 8 10,2 mm - 9 8,6 mm 5,6 mm 10 10,7 mm 6,3 mm 11 11,9 mm 7,4 mm 12 13,8 mm 8,9 mm 13 18,5 mm 10,6 mm 14 12,7 mm 7,0 mm 15 11 mm 8,3 mm 16 7,8 mm 8,2 mm 17 11,1 mm 6,5 mm 18 6,0 mm 7,6 mm 19 6,2 mm 7,3 mm 20 6,8 mm 5,7 mm 21 7,8 mm 6,8 mm 22 7,7 mm 7,7 mm 23 12,7 mm 13,8 mm 24 12,9 mm 14,7 mm 25 11,2 mm 13,3 mm Kontrol + kloramfenikol 26,3 mm 28,3 mm Kontrol - n-heksan - - Kontrol - etil asetat - - Kontrol - metanol - - Keterangan : - = tidak ada aktivitas antibakteri