Pembuatan dan Partisi Ekstrak

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta hanya tinggal selapis larutan diatas permukaan sampel, kemudian ditambahkan pelarut dengan tingkat kepolaran kedua yaitu n-heksan : etil asetat dengan 9 : 1 sebanyak 700 mL, dan ditampung eluatnya seperti sebelumnya. Fraksinasi dilakukan hingga fasa gerak yang digunakan telah mencapai gradien akhir yaitu etil asetat 100. Hasil eluat yang telah ditampung dalam vial yang telat diberi nomor secara berurutan di analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT untuk melihat pola noda masing-masing eluat. Eluat yang memberikan pola noda dengan nilai Rf yang sama, digabungkan menjadi satu dan selanjutnya diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi. 3.3.5.2.Kromatografi Lapis Tipis KLT KLT dilakukan untuk mengamati pola pemisahan dari fraksi hasil kromatografi kolom. Sebagai fase gerak digunakan pelarut pengembang yang sesuai, dilakukan uji coba untuk mendapatkan perbandingan pelarut yang memberikan pemisahan yang terbaik. Fase gerak yang telat dibuat, dimasukkan ke dalam bejana KLT dan dimasukkan kertas saring untuk menjenuhkan larutannya, bejana ditutup dan biarkan sampai kertas saring terbasahi semuanya. Selanjutnya, fraksi dilarutkan dengan pelarut yang sesuai dan ditotolkan pada plat KLT menggunakan pipa kapiler dengan posisi di garis batas bawah. Plat KLT dielusi di dalam masing-masing bejana KLT yang berisi fase gerak hingga fase gerak mencapai garis batas atas, kemudian diangkat. Plat KLT dibiarkan kering di udara, kemudian dilakukan pengamatan di lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Diberi tanda spot yang terlihat dalam lampu UV dan dihitung Rf dari tiap noda yang terlihat. 3.3.5.3.Rekristalisasi Untuk senyawa berbentuk kristal, pemurniannya dapat dilakukan dengan rekristalisasi. Rekristalisasi dilakukan dengan cara melarutkan senyawa dengan pelarut atau campuran pelarut yang cocok. Pelarut yang dipilih berdasarkan kemampuan melarutkan zat yang akan dimurnikan. Adanya perbedaan kelarutan akibat penambahan pelarut lain akan menyebabkan senyawa utama akan mengkristal lebih dahulu Rositawati, dkk. 2013. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.6. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram digunakan untuk identifikasi anggota dari domain bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diambil masing-masing 1 ose dan digores-goreskan pada permukaan kaca objek steril, ditetesi NaCl 0,9 , kemudian dilakukan fiksasi. Kristal violet sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek yang terdapat lapisan bakteri tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, kaca objek dibilas dengan air sampai zat warna luntur. Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, larutan lugol sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, kaca objek dibilas dengan air. Kaca objek dibilas dengan alkohol 96 sampai semua zat warna luntur kemudian dicuci dengan air. Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, safranin sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek dan didiamkan selama 45 detik. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan. Preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x Pratiwi, 2008.

3.3.7. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi dari Ekstrak Etil Asetat Buah Parijoto

a. Pembuatan Medium serta Sterilisasi Alat dan Bahan

Medium yang digunakan untuk membiakkan bakteri uji adalah medium NA Nutrient Agar. Serbuk NA sebanyak 2,8 gram dicampur dengan 100 mL aquadest di dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan stirer di atas hotplate hingga larut. Medium yang digunakan untuk membuat suspensi bakteri adalah BHI Brain Heart Infussion. Serbuk BHI sebanyak 3,7 gram dicampur dengan 100 mL aquadest di dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan stirer di atas hotplate hingga larut. Bahan yang telah dibuat disumbat dengan kapas yang telah dibungkus kasa, termasuk aquadest dan NaCl 0,9. Cawan petri yang telah dibungkus dengan kertas, tabung reaksi yang telah disumbat dengan kapas dilapisi kasa, dan tip dimasukkan ke dalam plastik tahan panas. Seluruh alat dan bahan yang telah siap disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit. Setelah