UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
daya yang lebih besar akan meningkatkan nilai Rf. Untuk KLT yang menggunakan silika gel sebagai adsorbennya, pelarut yang digunakan bersifat
sedikit polar Sherma dan Fried, 2003. Hal-hal yang perlu diperhatikan pada saat penggunaan pelarut pada KLT
eluen antara lain : eluen harus murni, campuran eluen yang digunakan dapat terdiri dari dua sampai tiga jenis eluen, komposisi eluen dapat berubah karena
penyerapan atau penguapan, komponen campuran eluen kemungkinan dapat bereaksi satu sama lain Harmita, 2006.
C. Deteksi senyawa Senyawa yang sudah berwarna langsung dideteksi dengan mata,
sedangkan senyawa yang tidak berwarna dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm. Untuk senyawa yang menghasilkan fluoresensi, senyawa
tersebut diperiksa dengan sinar UV pada panjang gelombang 366 nm Sherma dan Fried, 2003. Jika dengan kedua cara itu senyawa tidak dapat dideteksi, maka
harus dicoba dengan menggunakan pereaksi kimia tanpa atau dengan pemanasan Stahl, 1985.
2.8.2. Kromatografi Kolom
Salah satu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar adalah menggunakan kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan kromatografi
cair dimana fase diam ditempatkan dalam tabung kaca berbentuk silinder pada bagian bawahnya tertutup dengan katup atau kran dan fase gerak dibiarkan
mengalir ke bawah karena adanya gaya gravitasi Gritter, Bobbit Schwarting, 1991. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam kromatografi kolom adalah :
a. Fase diam Fase diam untuk kolom biasanya berukuran 63 – 250 µm. Sifat fase diam
bergantung pada pH dan tingkat keaktifannya. Fase diam yang biasa digunakan adalah silika gel, selulosa, alumina, arang, polistiren atau poliamida Gritter,
Bobbit Schwarting, 1991.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
b. Fase gerak Fase gerak yang digunakan dapat dimulai dengan pelarut non polar
kemudian ditingkatkan kepolarannya secara bertahap, baik dengan pelarut tunggal ataupun kombinasi dua pelarut yang berbeda kepolarannya dengan perbandingan
tertentu sesuai tingkat kepolaran yang dibutuhkan Stahl, 1969. c. Pemilihan pelarut
Pemilihan pelarut perlu dilakukan untuk mengetahui pelarut atau campuran pelarut mana yang dapat menghasilkan pemisahan yang diinginkan. Hal
itu dapat dilakukan dengan tiga pendekatan yaitu, penelusuran pustaka, penerapan data KLT pada pemisahan dengan kolom, dan pemakaian elusi landaian umum
mulai dari pelarut yang tidak menggerakkan linarut sampai pelarut yang lebih polar yang menggerakkan linarut Gritter, Bobbit Schwarting, 1991.
d. Deteksi senyawa hasil kromatografi kolom Fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi ditampung dalam
penampung dengan ukuran yang dikehendaki dan dilihat profilnya dengan menggunakan metode KLT. Jika menghasilkan profil KLT yang mirip, maka
fraksi tersebut digabung. Fraksi yang telah digabung, selanjutnya diuapkan pelarutnya sehingga didapatkan isolat. Noda pada plat KLT dideteksi dengan
lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm untuk senyawa- senyawa yang mempunya gugus kromofor, dengan penampakan noda seperti
larutan Iod, FeCl
3
dan H
2
SO
4
dalam metanol 10 Stahl, 1969.
2.9. Pemurnian Senyawa
Pemurniaan dilakukan untuk memisahkan senyawa yang menjadi target dari pengotornya. Pemurnian senyawa dapat dilakukan dengan berbagai cara,
diantaranya :
2.9.1. Rekristalisasi
Rekristalisasi adalah teknik pemurnian suatu zat padat dari campuran atau pengotornya yang dilakukan dengan cara mengkristalkan kembali zat tersebut
setelah dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Ada beberapa syarat agar suatu pelarut dapat digunakan dalam proses kristalisasi yaitu : memberikan perbedaan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
daya larut yang cukup besar antara zat yang dimurnikan dengan zat pengotor, tidak meninggalkan zat pengotor pada kristal, dan mudah dipisahkan dari
kristalnya Rositawati, dkk., 2013. Prinsip dasar rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan antara zat yang
akan dimurnikan dengan kelarutan zat pencampur atau pencemarnya. Larutan yang terbentuk dipisahkan satu sama lain, kemudian larutan zat yang diinginkan
dikristalkan dengan cara menjenuhkannya Rositawati, dkk., 2013.
2.10. Uji Kemurnian
Kemurnian merupakan hal yang penting dimiliki suatu senyawa hasil isolasi. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji kemurniaan terhadap senyawa hasil
isolasi. Metode yang dapat digunakan untuk uji kemurniaan antara lain dengan penentuan titik leleh dan penggunaan KLT dua dimensi.
2.10.1. Penentuan Titik Leleh
Titik leleh suatu padatan kristalin didefinisikan sebagai suhu dimana padatan berubah menjadi cairan di bawah tekanan total satu atmosfer. Senyawa
murni memiliki rentang titik leleh yang tajam dimana jarak temperatur senyawa tersebut sangat kecil ketika berubah sempurna dari padat ke cair. Rentang
temperatur maksimum untuk senyawa murni adalah 1-2 C Margono dan
Zandrato, 2006. Penentuan titik leleh adalah salah satu metode yang cepat dan mudah
untuk memastikan kemurnian dari suatu padatan dengan mengukur titik lelehnya. Teknik penentuan titik leleh dari senyawa organik menggunakan metode mikro
dengan menggunakan pipa kapiler banyak digunakan karena mudah, menggunakan sampel yang sedikit dan datanya memuaskan Gilbert dan Martin,
2011. Ada beberapa pertimbangan dalam menentukan titik leleh. Diantaranya
adalah rentang titik leleh yang diamati bergantung pada beberapa faktor yaitu : jumlah sampel, laju pemanasan selama penentuan, dan kemurnian serta sifat kimia
dari sampel. Akurasi dari pengukuran suhu bergantung sepenuhnya pada kualitas dan kalibrasi dari termometer Gilbert dan Martin, 2011.
