Deteksi Virus Chikungunya Pada Nyamuk
tersebut ditambahkan ethanol sebanyak 560µl, lalu vortex selama 15 detik dan sentrifuse
5 detik; Ketiga, sebanyak 630µl larutan tersebut dipindahkan ke dalam spin column
yang terpasang pada collection tube, dan sentrifuseselama 30 detik, kemudian collection tube dibuang dan diganti dengan collection tubeyang baru
langkah tersebut diulangi sampai campuran habis;Keempat, selanjutnya ditambahkan 600µl AW1, lalusentrifuseselama 30 detik, dancollection tube
dibuang sertadiganti, kemudian ditambahkan lagi 600µl AW2, lalu sentrifuse
selama 30 detik, lalu collection tube dibuang dan diganti, setelah itusentrifusedengan kecepatan maksimum 1 menit dengan tujuan untuk
mengeringkan, collection tube dibuang dan spin column dipindahkan ke eppendorf 1.5 ml.Kemudian ditambahkan buffer AVE 60µl tepat ditengah tanpa
menyentuh dinding atau filter,lalu didiamkan selama
3 menit dansentrifusedengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit.Hasil ekstraksi RNA
tersebut dapat langsung digunakan sebagai template
RT-PCR
atau dapat simpan pada suhu -80°C bila tidak digunakan.
RT-PCR
DeteksiRNA virus chikungunya dengan menggunakan pasangan Primermenggunakan Primer forward CHIKnsP1-S dengan sekuens 5’-TAG-
AGC-AGG-AAA-TTG-ATC-CC-3’ dan Primer reverse CHIKnsP1-C dengan sekuens 5’-CTT-TAA-TCG-CCT-GGT-GGT-AT-3’ Rohani
et al. 2005.Sebelum di lakukan RT- PCR, perlu disiapkan campuran PCR Master Mix
PCR di atas cold block dalam biosafety cabinetuntuk volumereaksi 12.5µl, yang terdiri atas beberapa reagen sebagai berikut: dH20 1.25 µl, 2x buffer6.25 µl,
Primer forward 200 pmole 0.25 µl, Primer reverse 200 pmole 0.25 µl, Enzyme 0.25 µl. Masukkan 8.5 µl campuran PCR kedalam masing-masing tabung PCR
dan ditambahkan 4 µl template untuk setiap sampel.Tabung tersebut ditutup rapat dan disentrifuse, kemudian tempatkan
pada mesin PCR untuk amplifikasi.Amplifikasi dilakukan pada total volumereaksi 12.5 µl menggunakan
Superscript III one-step RT-PCR kit Invitrogen dengan 200 pmol primers dan 4
µl template RNA.Kondisi PCR diawali dengan tahapreverse traskripsi pada suhu 48°C selama 30 menit, yang diikuti dengan 35 siklus denaturasi pada 94°C selama
1 menit, Anneling pada 54°Cselama 90 detik dan ekstensi pada 72°Cselama 2
menit serta diakhiri ekstensi final pada 72°Cselama 7 menit Rohani et al. 2005; Thavara et al. 2009.
Elektroforesis
Produk amplifikasi selanjutnya diseparasi pada 1 gel agarose. Gel agarose 1 dibuat dengan cara mencampurkan 1 gram agarose dengan 100ml TAE buffer,
kemudian dipanaskan pada microwave sampai larut, diaduk rata dan didinginkan pada air mengalir sampai hangat. Selanjutnya ditambahkan 5 µl etidium bromida
0.5 µl10 ml agarosa kemudian diaduk rata. Gel tersebut dimasukkan ke dalam cetakan, dibiarkan dingin dan mengeras ±30 menit. Setelah agarose mengeras,
dimasukkan ke dalam tangki chamber elektroforesis yang berisi buffer TAE.Berikutnya disiapkan 1 µl loading dye 6x, ditambahkan produk PCR 5 µl
dan diaduk sampai merata di atas kertasparafilm, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran pada gel agarose, lalu masukkan pula berturut-turut5 µl Ladder DNA 1
kb diletakkan sesuai kebutuhan,5 µl kontrol negatif dan 5 µl kontrol positif pada sumur-sumur berikutnya.Kontrol positif adalah hasil amplifikasi PCR yang berisi
master mix yang dicampur dengan RNA virus chikungunya yang diperoleh dari
Pusat Studi Satwa Primata Institut Pertanian Bogor PSSP-IPB.Kontrol negatif adalah hasil amplifikasi PCR yang berisi master mix yang dicampur dengan
RNAase-free water. Elektroforesis dengan arus listrik 120 Vselama 45 menit,
DNA akan bergerak dari kutup negatif ke kutub positif.
Visualisasi
Setelah dielektroforesis, gel agarose diletakkandi atas transluminator ultra violet
untuk melihat hasil amplifikasi. Pita molekul yang terlihat pada gel agarose menandakan adanya segmen DNA. Pita DNA tersebut kemudian dibandingkan
dengan pita yang ada pada kontrol positif dan Ladder atau marker.