rumah dan 1 orang lagi menangkap di luar rumah.Penangkapan nyamuk dengan umpan orang dilakukan selama 20 menit per rumah dan 5 menit selanjutnya
menangkap nyamuk yang sedang istirahat. Tiap penangkap duduk dengan celana digulung sampai lutut dan menunggu 20 menit untuk digigit nyamuk. Nyamuk
yang hinggap langsung ditangkap dengan aspirator dan dimasukkan dalam gelas kertas atau paper cup dibedakan per rumah dan metode penangkapan, kemudian
dibawa ke laboratorium dan dimasukkan freezer -20°C.Keragaman spesies dan kepadatan nyamuk yang tertangkap dihitung Landing Rate LR, Man Biting Rate
MBR, Resting Rate RR.Pengumpulan nyamuk dewasa dilakukan 2 kali seminggu selama 4 bulan dari jam 06.00 sampai jam 18.00.
3.2.5 Identifikasi Nyamuk
Nyamuk yang telah dikumpulkan tersebut, diidentifikasi sesuai kunci identifikasi Depkes 2008.Nyamuk dipisahkan berdasarkan jenis, waktu, lokasi
pengambilan dan dimasukkan kedalam tabung eppendorf sebanyak 5-25 ekor per tabung, laludimasukkan freezerdengan suhu -80°C sampai dilakukanRT-PCR.
3.2.6 Deteksi Virus Chikungunya Pada Nyamuk
Pemeriksaanvirus chikungunya dalam tubuh nyamuk di lakukan terhadap semua nyamuk hasil penangkapan dari lapangan dengan
RT-PCR
. Kegiatan yang dilakukan meliputi: 1 Ekstraksi RNA virus; 2 Pengujian
RT-PCR
Ekstraksi RNA Virus
Ekstraksi RNA virus diawali dengan menggerus nyamuk menggunakan pestle
kemudian ditambahkan media BA1 sesuai jumlah nyamuk. Sebanyak 10- 25 nyamukditambahkan BA1 1ml; 5-10 nyamukditambahkan BA1 500 µl; dan
bila kurang dari 5 nyamukditambahkan BA1 250µl. Gerusan diaduk sampai larut, setelah itu sentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 3 menit, kemudian
140 µl supernatan diambil untuk ekstraksi RNA virus dengan tahapan sebagai berikut: Pertama, sebanyak 560 lysis mix yang terdiri atas 560 µl AVL dan 5.6µl
RNA-carrier dimasukkan ke dalam tabung eppendorf1.5ml, lalu ditambahkan
sampel 140µl, kemudian vortexselama 15 detik, setelah itu di inkubasi dalam room temperature
RT selama10 menit;Kedua, selanjutnya langkah pertama
tersebut ditambahkan ethanol sebanyak 560µl, lalu vortex selama 15 detik dan sentrifuse
5 detik; Ketiga, sebanyak 630µl larutan tersebut dipindahkan ke dalam spin column
yang terpasang pada collection tube, dan sentrifuseselama 30 detik, kemudian collection tube dibuang dan diganti dengan collection tubeyang baru
langkah tersebut diulangi sampai campuran habis;Keempat, selanjutnya ditambahkan 600µl AW1, lalusentrifuseselama 30 detik, dancollection tube
dibuang sertadiganti, kemudian ditambahkan lagi 600µl AW2, lalu sentrifuse
selama 30 detik, lalu collection tube dibuang dan diganti, setelah itusentrifusedengan kecepatan maksimum 1 menit dengan tujuan untuk
mengeringkan, collection tube dibuang dan spin column dipindahkan ke eppendorf 1.5 ml.Kemudian ditambahkan buffer AVE 60µl tepat ditengah tanpa
menyentuh dinding atau filter,lalu didiamkan selama
3 menit dansentrifusedengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit.Hasil ekstraksi RNA
tersebut dapat langsung digunakan sebagai template
RT-PCR
atau dapat simpan pada suhu -80°C bila tidak digunakan.
RT-PCR
DeteksiRNA virus chikungunya dengan menggunakan pasangan Primermenggunakan Primer forward CHIKnsP1-S dengan sekuens 5’-TAG-
AGC-AGG-AAA-TTG-ATC-CC-3’ dan Primer reverse CHIKnsP1-C dengan sekuens 5’-CTT-TAA-TCG-CCT-GGT-GGT-AT-3’ Rohani
et al. 2005.Sebelum di lakukan RT- PCR, perlu disiapkan campuran PCR Master Mix
PCR di atas cold block dalam biosafety cabinetuntuk volumereaksi 12.5µl, yang terdiri atas beberapa reagen sebagai berikut: dH20 1.25 µl, 2x buffer6.25 µl,
Primer forward 200 pmole 0.25 µl, Primer reverse 200 pmole 0.25 µl, Enzyme 0.25 µl. Masukkan 8.5 µl campuran PCR kedalam masing-masing tabung PCR
dan ditambahkan 4 µl template untuk setiap sampel.Tabung tersebut ditutup rapat dan disentrifuse, kemudian tempatkan
pada mesin PCR untuk amplifikasi.Amplifikasi dilakukan pada total volumereaksi 12.5 µl menggunakan
Superscript III one-step RT-PCR kit Invitrogen dengan 200 pmol primers dan 4
µl template RNA.Kondisi PCR diawali dengan tahapreverse traskripsi pada suhu 48°C selama 30 menit, yang diikuti dengan 35 siklus denaturasi pada 94°C selama
1 menit, Anneling pada 54°Cselama 90 detik dan ekstensi pada 72°Cselama 2
