Identifikasi Nyamuk Rancangan Penelitian

tersebut ditambahkan ethanol sebanyak 560µl, lalu vortex selama 15 detik dan sentrifuse 5 detik; Ketiga, sebanyak 630µl larutan tersebut dipindahkan ke dalam spin column yang terpasang pada collection tube, dan sentrifuseselama 30 detik, kemudian collection tube dibuang dan diganti dengan collection tubeyang baru langkah tersebut diulangi sampai campuran habis;Keempat, selanjutnya ditambahkan 600µl AW1, lalusentrifuseselama 30 detik, dancollection tube dibuang sertadiganti, kemudian ditambahkan lagi 600µl AW2, lalu sentrifuse selama 30 detik, lalu collection tube dibuang dan diganti, setelah itusentrifusedengan kecepatan maksimum 1 menit dengan tujuan untuk mengeringkan, collection tube dibuang dan spin column dipindahkan ke eppendorf 1.5 ml.Kemudian ditambahkan buffer AVE 60µl tepat ditengah tanpa menyentuh dinding atau filter,lalu didiamkan selama 3 menit dansentrifusedengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit.Hasil ekstraksi RNA tersebut dapat langsung digunakan sebagai template RT-PCR atau dapat simpan pada suhu -80°C bila tidak digunakan. RT-PCR DeteksiRNA virus chikungunya dengan menggunakan pasangan Primermenggunakan Primer forward CHIKnsP1-S dengan sekuens 5’-TAG- AGC-AGG-AAA-TTG-ATC-CC-3’ dan Primer reverse CHIKnsP1-C dengan sekuens 5’-CTT-TAA-TCG-CCT-GGT-GGT-AT-3’ Rohani et al. 2005.Sebelum di lakukan RT- PCR, perlu disiapkan campuran PCR Master Mix PCR di atas cold block dalam biosafety cabinetuntuk volumereaksi 12.5µl, yang terdiri atas beberapa reagen sebagai berikut: dH20 1.25 µl, 2x buffer6.25 µl, Primer forward 200 pmole 0.25 µl, Primer reverse 200 pmole 0.25 µl, Enzyme 0.25 µl. Masukkan 8.5 µl campuran PCR kedalam masing-masing tabung PCR dan ditambahkan 4 µl template untuk setiap sampel.Tabung tersebut ditutup rapat dan disentrifuse, kemudian tempatkan pada mesin PCR untuk amplifikasi.Amplifikasi dilakukan pada total volumereaksi 12.5 µl menggunakan Superscript III one-step RT-PCR kit Invitrogen dengan 200 pmol primers dan 4 µl template RNA.Kondisi PCR diawali dengan tahapreverse traskripsi pada suhu 48°C selama 30 menit, yang diikuti dengan 35 siklus denaturasi pada 94°C selama 1 menit, Anneling pada 54°Cselama 90 detik dan ekstensi pada 72°Cselama 2