Lokasi Penelitian dan Waktu Penelitian Prosedur Analisis 1. TPC Fardiaz 1993

hingga kering. Bubuk lindur kering digiling menggunakan blender hingga menjadi serbuk kasar. Serbuk kasar diayak dengan menggunakan ayakan 65 mesh. Prosedur pembuatan tepung lindur dapat dilihat pada Gambar 3. Gambar 3. Diagram alir pembuatan tepung lindur dari buah lindur

3.4.1.4 Pembuatan Ekstrak Lindur dari Tepung Lindur

Ekstraksi sampel dilakukan dengan metode maserasi menurut metode Malangngi et al. 2012. Sebanyak 20 g sampel direndam dalam 100 ml etanol 95 selama 24 jam kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat filtrat pertama. Sisa padatan diperlakukan sama guna mendapatkan filtrat kedua. Kedua filtrat yang diperoleh disatukan, kemudian diuapkan menggunakan rotavapor sehingga diperoleh ekstrak lindur. Penimbangan dilakukan terhadap labu kosong sebagai bobot awal dan labu setelah didapat ekstrak. Bobot filtrat dihitung dari selisih bobot akhir setelah evaporasi dengan bobot awal labu kosong. Ekstrak hasil evaporasi dalam labu kemudian dilarutkan dalam 10 ml etanol. Sisa ekstrak yang menempel dalam labu dilarutkan dengan bantuan sonikator. Ekstrak yang didapat kemudian didinginkan dalam desikator sebelum analisis lebih lanjut. Prosedur kerja pembuatan ekstrak lindur dari tepung lindur dapat dilihat pada Gambar 4. Buah lindur Pembuangan kulit dan perendaman Ekstraksi selama 60 menit, suhu 100°C Penghancuran kasar Penjemuran hingga kering Penghancuran dengan blender Pengayakan menggunakan saringan mesh 65 Analisis kimia Tepung lindur Gambar 4. Diagram alir pembuatan ekstrak lindur dari tepung lindur

3.4.1.5 Pengujian aktivitas antimikroba

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari kitosan dan ekstrak lindur terhadap bakteri uji Salmonella dan S.aureus menggunakan metode uji difusi agar dengan kertas cakram. Satu ose isolat bakteri Salmonella dan S.aureus masing-masing diinokulasi ke dalam 9 ml media NB, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Kultur sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam cawan petri dan dituangkan media agar sebanyak 20 ml, dibiarkan membeku. Siapkan kertas saring atau kertas cakram berbentuk bulat dengan diameter 6 mm yang sudah disterilkan. Selanjutnya ke dalam kertas cakram diteteskan ekstrak lindur atau kitosan yang telah dilarutkan dalam asam asetat dengan konsentrasi berbeda sebanyak 60 µL diatas atau pada kertas saring, biarkan sampai semua kertas saring tersebut menyerap senyawa antimikroba. Tiriskan kertas cakram sampai tidak menetes dan letakkan kertas cakram tersebut diatas permukaan agar yang telah memadat 3 cakram per cawan. Kemudian cawan petri diinkubasi pada suhu 37 °C dan setelah 24 jam dilakukan pengamatan terhadap zona bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong. Pengukuran dilakukan pada setiap sisi Lioe et al. 2012. Maserasi dengan etanol 95 selama 48 jam Penyaringan hingga didapat filtrat Evaporasi hingga didapat ekstrak lindur dan etanol Sonikasi dengan etanol 10 ml Ekstrak lindur Tepung lindur

3.4.2 Penelitian Utama Aplikasi Edible Coating pada Udang Kupas

Penelitian utama terdiri atas dua seri penelitian, yaitu Penelitian Seri Pertama dan Penelitian Seri Kedua. Dalam Penelitian Seri Pertama digunakan konsentrasi kitosan sebanyak 0 , 1 , 2 dengan asam asetat 1 sebagai pelarut bv. Konsentrasi ekstrak lindur sebanyak 0 , 1 dan 2 dengan etanol sebagai pelarut vv. Udang yang digunakan adalah jenis Black tiger. Sedangkan untuk Penelitian Seri Kedua digunakan konsentrasi kitosan sebanyak 0 dan 1 dengan asam asetat 1 sebagai pelarut bv, serta konsentrasi ekstrak lindur sebanyak 0 , 1 dan 2 dengan etanol sebagai pelarut vv. Udang yang digunakan adalah jenis udang vannamei. Kitosan dan ekstrak lindur masing-masing konsentrasi dilarutkan dalam air destilata, dilakukan penambahan agar 1 bv, dan gliserol 0.5 vv kemudian dipanaskan hingga mendidih. Larutan kemudian didinginkan hingga suhu sekitar 40 °C. Setelah itu, larutan diaplikasikan sebagai edible coating dengan cara mencelupkan udang kupas selama 5 detik. Udang kupas yang telah dilapisi edible coating kemudian ditiriskan pada suhu kamar sampai lapisan edible coating mengering. Udang kupas kemudian disimpan pada suhu dingin 10 °C. Diagram alir prosedur aplikasi edible coating pada udang kupas dapat dilihat pada Gambar 5. Pada Penelitian Seri Pertama, analisis yang dilakukan meliputi uji TPC, TVB, pH dan organoleptik hedonik meliputi parameter warna, aroma, tekstur dan penerimaan umum pada penyimpanan 1 dan 7 hari pada suhu dingin 10 °C. Pada Penelitian Seri Kedua, analisis yang dilakukan meliputi uji Vibrio, TPC, TVB, pH, uji warna dengan kromameter, uji tekstur dengan Texture Profile Analyzer, uji organoleptik meliputi uji hedonik dan mutu rasa untuk udang matang yang direbus selama sekitar 5 menit pada suhu sekitar 100 °C serta kenampakan, aroma dan tekstur untuk udang matang dan mentah. Pengamatan dilakukan selama 1 hari, 4 hari dan 7 hari penyimpanan pada suhu dingin 10 °C. Gambar 5. Diagram alir prosedur aplikasi edible coating kitosan-ekstrak lindur Udang kupas Pembuatan larutan coating dari ekstrak lindur+kitosan+gliserol+agar+air Pencelupan dalam larutan sekitar 40 °C selama 5 detik Penirisan pada suhu kamar selama 1 menit Penyimpanan pada suhu dingin 10 °C

3.5 Prosedur Analisis 1. TPC Fardiaz 1993

Perhitungan jumlah bakteri total menggunakan metode TPC Total Plate Count prinsipnya adalah menentukan populasi bakteri yang terdapat pada bahan pangan. Prosedur kerjanya yaitu sampel 5 g ditimbang secara aseptis dan representatif, kemudian dimasukkan dalam blender steril dan ditambahkan 45 ml NaCl 0.85 steril lalu diblender sampai homogen. Larutan yang diperoleh adalah pengenceran 1:10. Selanjutnya tahap inokulasi yaitu sebanyak 1 ml dari larutan 1:10 dimasukkan dalam cawan petri steril, lalu ditambahkan larutan media PCA steril bersuhu 45 °C sebanyak 25 ml dan dibiarkan selama 15-20 menit sampai agar memadat. Proses ini dilakukan juga pada larutan dengan pengenceran 1:100 sampai 1:10.000.000, secara duplo. Setelah media yang telah diinokulasi memadat, kemudian dilakukan tahap inkubasi yaitu cawan petri diinkubasi pada suhu 37 °C dengan posisi terbalik selama 48 jam. Perhitungan jumlah bakteri berdasarkan ISO Standard for Microbiological Methods Lioe et al. 2012, yaitu : N = Σ c ÷ n 1 + 0.1 n 2 x d Dimana : Σ c = jumlah koloni bakteri pada semua cawan yang mengandung 25-250 koloni n 1 = jumlah cawan petri yang masuk perhitungan pada pengenceran pertama n 2 = jumlah cawan petri yang masuk perhitungan pada pengenceran berikutnya d = faktor pengenceran pertama

2. Derajat Keasaman pH AOAC 2000

Pengukuran nilai pH dilakukan menggunakan pH-meter Autech Instrument dan Thermo Scientific yang telah dikalibrasi menggunakan buffer pH 7 dan pH 4. Sampel yang ditambahkan akuades perbandingan 1:2 bv, dan dihancurkan dengan homogenizer. Elektroda dicelup dalam larutan sampel sampai diperoleh pembacaan angka yang stabil, lalu nilai pH dicatat.

3. TVB AOAC 2000

Prinsip penetapan Total Volatile Base TVB adalah menguapkan senyawa-senyawa basa volatil amonia, mono-, di-, tri- metil amin, dan lain-lain di dalam ekstrak sampel yang bersifat basa pada suhu 35 °C selama 2 jam atau suhu kamar selama semalam. Senyawa-senyawa tersebut akan diikat oleh asam borat kemudian dititrasi dengan HCl. Prosedur kerjanya yaitu sebanyak 10 g sampel ditimbang. Kemudian dihomogenkan dengan ditambahkan 75 ml larutan TCA trikloroasetat 7 bv dengan homogenier selama 1 menit. Larutan disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh filtrat yang jernih. Cawan conway disiapkan, yaitu dengan menuang 1 ml asam borat dalam inner chamber, sedangkan filtrat dan K 2 CO 3 jenuh dituang dalam outer chamber pada arah yang berlawanan masing-masing sebanyak 1 ml. Setelah cawan ditutup rapat ditambahkan vaselin, kemudian dimasukkan dalam inkubator suhu 35 °C selama 2 jam dan sebelumnya cawan digoyang dengan hati-hati sampai filtrat K 2 CO 3 bercampur. Setelah inkubasi, larutan asam borat dalam inner chamber dititrasi dengan larutan HCl N70 sampai larutan asam borat berubah warna. Pada blanko, filtrat diganti dengan TCA 7 . Nilai TVB diukur dengan persamaan sebagai berikut: TVB mgN100 = a - b x N HCl x 14.007 x 100g sampel x 100l Dimana : a = ml titrasi HCl pada sampel b = ml titrasi HCl pada blanko

4. Pengukuran Tekstur Udang secara Objektif

Tekstur udang dianalisis dengan menggunakan alat Texture Analyzer TA- XT plus yang telah dilengkapi dengan sistem komputerisasi. Pengukuran dengan metode Texture Profile Analysis dilakukan dengan terlebih dahulu memilih setting Texture Profile Analysis pada program Texture Analyzer. Sampel kemudian ditempatkan pada wadah uji dan dilakukan pengukuran tekstur melalui pemberian gaya tekan compression sebanyak dua kali yang merupakan simulasi dari proses pengunyahan di dalam mulut. Output hasil pengukuran berupa grafik kemudian dianalisis untuk menghitung parameter rheologi yang diinginkan.Hasil grafik yang didapat kemudian dianalisis parameternya melalui perhitungan yang masing-masing profil tekstur memiliki perhitungannya sendiri. Pembacaan grafik dibantu dengan menggunakan program Texture Exponent Lite 4.0.7.0 dari Visual Components Incorporation.Melalui program ini didapatlah nilai titik tertinggi dari puncak kurva pertama, luas area puncak kurva 1 dan luas area puncak kurva 2, serta waktu yang digunakan saat penekanan pertama dan penekanan kedua. Setelah didapatkan nilai-nilai tersebut, lalu dihitung parameter profil teksturnya. Parameter profil tekstur yang dihitung adalah kekerasan, elastisitas, daya kunyah, kohesivitas, dan kelengketan gumminess.

5. Analisis warna HunterLab ColorFlex EZ spectophotometer

Sampel di letakan pada gelas beker sampai seluruh dasar gelas beker tertutupi oleh bahan. Analisis warna kemudian dilakukan dengan menggunakan Hunterlab ColorFlex EZ spectrophotometer. Uji warna udang dilakukan dengan sistem warna Hunter L, a, b. Chromameter terlebih dahulu dikalibrasi dengan standar warna putih yang terdapat pada alat tersebut. Hasil analisis yang dihasilkan berupa nilai L, a, b.

6. Uji Organoleptik BSN 2006

Uji organoleptik Penelitian Seri Pertama meliputi penilaian hedonik terhadap warna, aroma dan tekstur serta penerimaan umum pada udang kupas mentah selama penyimpanan 1 dan 7 hari pada suhu dingin 10 °C dengan tujuan untuk mengetahui tanggapan panelis terhadap produk. Kuesioner uji hedonik dapat dilihat pada Lampiran 2. Penilaian hedonik dilakukan untuk udang kupas mentah dan matang dengan skor 0 hingga 7. Pengamatan dilakukan pada satu hari dan satu minggu penyimpanan. Pengujian organoleptik yang dilakukan adalah uji skoring menggunakan 30 orang panelis tidak terlatih. Sampel yang akan diamati diberi kode sesuai dengan tabel kode contoh. Uji organoleptik Penelitian Seri Kedua meliputi penilaian mutu inderawi terhadap rasa untuk udang kupas matang, serta terhadap aroma, tekstur dan kenampakan untuk udang kupas mentah dan matang. Pengamatan dilakukan pada 1 hari, 4 hari dan 7 hari penyimpanan. Pengujian organoleptik yang dilakukan adalah uji skoring menggunakan 7 orang panelis terlatih yang telah terakreditasi oleh badan KAN. Sampel yang akan diamati diberi kode sesuai dengan tabel kode contoh . Instrumen ini lebih detail dapat dilihat pada Lampiran 3 dan Lampiran 4.

3.6 Rancangan Percobaan

Rancangan Percobaan yang digunakan dalam penelitian utama Penelitian Seri Pertama dan Penelitian Seri Kedua adalah rancangan faktorial dua faktor dengan dua ulangan. Semua analisis dilakukan secara duplo. Model matematika rancangan faktorial dapat dirumuskan sebagai berikut: ijk = µ + A i + B j + AB ij + Ɛ ijk Keterangan : ijk = Respon dari faktor A taraf ke-i, faktor B taraf ke-j dan ulangan ke- k µ = Nilai tengah umum A i = Pengaruh faktor A kitosan pada taraf ke-i B j = Pengaruh faktor B ekstrak lindur pada taraf ke-j AB ij = Pengaruh interaksi faktor A taraf ke-i dengan faktor B taraf ke-j ɛ ijk = Pengaruh galat dalam percobaan Pada Penelitian Seri Pertama, parameter yang diamati meliputi TPC, pH, TVB, dan karakteristik organoleptik yang dilakukan pada penyimpanan 1 hari dan 7 hari. Faktor pertama adalah konsentrasi kitosan K dengan 3 taraf K0 = 0 , K1 = 1 dan K2 = 2 . Faktor kedua adalah konsentrasi lindur L dengan 3 taraf L0 = 0 , L1 = 1 dan L2 = 2 . Dengan demikian total kombinasi perlakuan terdiri atas 9 kombinasi, yaitu kontrol kitosan 0 ; lindur 0 K0L0, kitosan 0 ; lindur 1 K0L1, kitosan 0 ; lindur 2 K0L2, kitosan 1 ; lindur 0 K1L0, kitosan 1 ; lindur 1 K1L1, kitosan 1 ; lindur 2 K1L2, kitosan 2 ; lindur 0 K2L0, kitosan 2 ; lindur 1 K2L1, kitosan 2 ; lindur 2 K2L2. Pada Penelitian Seri Kedua, parameter yang diamati meliputi TPC, pH, TVB, dan karakteristik organoleptik yang dilakukan pada penyimpanan 1 hari, 4 hari dan 7 hari. Faktor pertama adalah konsentrasi kitosan K dengan 2 taraf K0 = 0 dan K1 = 1 . Faktor kedua adalah konsentrasi lindur L dengan 3 taraf L0 = 0 , L1 = 1 dan L2 = 2 . Dengan demikian terdapat 6 kombinasi perlakuan terhadap udang kupas, yaitu kontrol kitosan 0 ; lindur 0 K0L0, kitosan 0 ; lindur 1 K0L1, kitosan 0 ; lindur 2 K0L2, kitosan 1 ; lindur 0 K1L0, kitosan 1 ; lindur 1 K1L1 dan kitosan 1 ; lindur 2 K1L2. Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis ragam ANOVA untuk mengetahui adanya pengaruh masing-masing faktor dan interaksinya terhadap setiap parameter uji menggunakan IBM SPSS Statistik Software Versi 20.0, IBM SPSS Inc, Armonk, NY, USA SPSS 2000. Jika dalam analisis ragam terdapat ada pengaruh nyata dari salah satu faktor atau kedua faktor dan interaksinya, analisis statistik dilanjutkan dengan uji jarak Duncan untuk melihat perbedaan dari masing-masing perlakuan, pada taraf nyata 95 atau pada nilai p = 0.05 Sastrosupadi 2004. 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Penelitian Pendahuluan 4.1.1 Karakteristik Kimia Tepung dan Buah Lindur Berdasarkan hasil uji kimia yang meliputi analisis kadar air, kadar abu, protein, lemak, karbohidrat, HCN, tanin dan fitokimia didapatkan bahwa buah lindur dan tepung memiliki spesifikasi seperti yang dicantumkan dalam Tabel 1. Sedangkan untuk hasil uji fitokimia secara kualitatif dari buah lindur dicantumkan dalam Tabel 2. Tabel 1 Hasil uji kimia buah dan tepung lindur Parameter Buah Lindur Tepung Lindur Kadar Air 59,49 13,21 Kadar Abu bb 1,35 1,05 Kadar Protein bb 2,17 4,46 Kadar Lemak bb 0,27 0,03 Kadar Karbohidrat bb 14,85 47,43 Kadar Serat 21,87 33,82 Kadar HCN ppm 19,26 5,59 Kadar Tanin mg 34,11 25,25 Tabel 2 Hasil Uji Fitokimia Buah Lindur Senyawa yang terbentuk +- Proses yang terjadi Steroid + Terjadi perubahan warna dari merah ke biruhijau Alkaloid - Flavonoid + Lapisan amil alkohol berwarna merahkuninghijau Saponin - Fenol hidroquinon - Tanin + Terbentuk warna merah tua Buah lindur merupakan tumbuhan mangrove yang habitatnya berada di dekat wilayah perairan dan umumnya tumbuh di pesisir pantai. Kadar air buah lindur adalah 59.49 bb, sedangkan kadar air tepung lindur adalah 13.21 . Kadar abu buah lindur segar dan tepung lindur adalah berturut-turut 1.35 dan 1.3 . Kadar lemak buah lindur dan tepung lindur adalah berturut-turut 0.27 dan 0.03 . Kadar protein buah lindur segar dan tepung lindur adalah berturut- turut 2.17 dan 4.46 . Kadar karbohidrat buah lindur segar dan tepung lindur adalah berturut-turut 14.85 dan 47.43 dengan menggunaan metode luff schroll untuk menghitung kadar pati dalam buah dan tepung lindur. Kadar serat dihitung menggunakan perhitungan by difference dengan kadar serat dari buah lindur segar dan tepung lindur berturut-turut adalah 21.87 dan 33.82 . Kadar HCN adalah 19.26 ppm pada buah lindur segar dan 5.59 ppm pada buah lindur dengan 1x perebusan. Menurut Sudiyono 2010, batas normal kadar HCN yang dapat dikonsumsi manusia adalah 50 ppm sehingga kadar HCN buah lindur yang dijadikan bahan baku edible coating dalam penelitian ini masih di bawah batas aman untuk dikonsumsi. Asam sianida merupakan zat berbahaya. Menurut Purnomoadi 2008, kandungan sianida dapat diturunkan dengan menggunakan berbagai metode misalnya pengeringan dengan sinar matahari dan pemanasan buatan. Dua faktor dari proses pengeringan diketahui membantu proses penurunan sianida yaitu proses dehidrasi penghilangan air dan perusakan sel akibat panas. Berdasarkan proses pengujian untuk menjadi tepung, buah lindur mengalami proses pemanasan perebusan, perendaman dan pengeringan. Ketiga proses tersebut sangat berpengaruh dalam menurunkan kadar sianida. Akibatnya penurunan HCN dari buah segar menjadi tepung sangat signifikan. Hasil analisis kadar tanin rata-rata adalah 34.11 mg100 g untuk buah lindur segar dan 25.25 mg100 g tanin untuk penepungan langsung. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan tanin dalam buah lindur masih sangat aman untuk dikonsumsi karena nilai ADI tanin adalah 560 mgkg berat badanhari. Kadar tanin yang tinggi menyebabkan rasa pahit pada bahan makanan. Senyawa ini bersifat karsinogenik apabila dikonsumsi dalam jumlah berlebih dan kontinyu Sofro et al. 1992. Berdasarkan uji fitokimia secara kualitatif didapatkan bahwa ekstrak lindur memiliki kandungan senyawa steroid, flavonoid dan tanin sehingga lindur memiliki kapasitas sebagai antibakteri.

4.1.2 Karakteristik Kitosan

Sebelum digunakan sebagai bahan pengawet dan antibakteri, dilakukan analisis kitosan untuk mendapatkan informasi sifat dan karakteristik kitosan untuk selanjutnya dibandingkan dengan karakteristik kitosan komersil dari Laboratorium Protan. Berikut adalah hasil analisis kitosan dan perbandingannya dengan standar mutu kitosan seperti yang terlihat pada Tabel 3. Tabel 3 Karakteristik kitosan hasil produksi Parameter Karakteristik Kitosan komersil Kitosan uji Warna Coklat terang hingga putih Coklat terang hingga putih Ukuran partikel Flake hingga bubuk powder Serpihan kecil flake Derajat deasetilasi ≥ 80 - 85 80.25 Kadar air ≤ 10 13.6 Kadar abu ≤ 2 1.67 pH 1 7 - 8 7 Suptijah et al. 1992 Ukuran partikel kitosan sangat dipengaruhi oleh bahan baku yang digunakan. Bahan baku yang berasal dari kulit udang memiliki bentuk yang lebih halus dan mudah hancur selama proses pembuatan kitosan. Ukuran partikel akan mempengaruhi kelarutan kitosan, semakin kecil ukuran partikel maka semakin mudah kitosan larut dalam pelarut. Pada Tabel 3 terlihat bahwa ukuran partikel kitosan uji tidak terlalu berbeda dengan standar yang ada. Bentuk kitosan uji