40 Hepes
2 gram NaHCO
3
2 gram HCl 1N
secukupnya NaOH 1N
secukupnya Aquabides steril ad
1 liter Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes dan 2 gram NaHCO
3
dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 800 mL aquabides steril, dihomogenkan
dengan menggunakan stirer magnet, kemudian pH diukur dengan pH meter pH yang diiinginkan adalah 7,2 - 7,4; karena terlalu basa maka digunakan HCl 1N
untuk menyesuaikan pH. Kemudian ditambahkan aquabides steril sampai 1 L, dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF Laminar Air Flow,
dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL,
diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire datedan nama pembuat, dan disimpan pada suhu 2 - 8
o
C Sambrook, dkk., 1989.
3.9.2 Pembuatan media kultur lengkap MK-RPMI
Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10
Penisilin-Streptomisin 2
Fungizon Amfoterisin B 0,5
RPMI ad 100 mL
Cara Pembuatan: Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air
Flow, beri identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 - 8
o
C Sambrook, dkk., 1989.
41
3.9.3 Pembuatan media M199
Komposisi: M199 sachet, spesifikasi GIBCO Lot No. 819942, dengan Earle’s salt, dengan L-glutamine, tanpa NaHCO
3
, netto 9,5 gram
Aquabides 1 liter
NaHCO
3
2,2 gram Hepes
2 gram HCl
1 N NaOH
1 N Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet M199, 2,2 gram NaHCO
3
, 2 gram Hepes dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer. Ditambahkan 800 mL aquabides steril dan di
homogenkan menggunakan stirer magnet. Diatur pH 7,2-7,4 dengan menggunakan pH meter. Karena terlalu asam maka digunakan NaOH 1 N untuk
menyesuaikan pH. Ditambahkan aquabidest hingga volume 1 L dan dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum di dalam LAF Laminar Air Flow. Dipasang filter
aparatus steril pada botol duran 1 L steril. Lakukan proses penyaringan dengan menggunakan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi
identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat. Media disimpan pada suhu 2 - 8
o
C Handayani, dkk., 2001.
3.9.4 Pembuatan MK-M199
Komposisi : Foetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-streptomisin
3 Fungizon Amfoterisin B 1.
M199 ad 100 mL
42 Cara Pembuatan :
Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air Flow, diberi identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire
date dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 - 8
o
C Handayani, dkk., 2001.
3.10 Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Buah Andaliman EEBA
Pengujian efek sitotoksik EEBA terhadap sel kanker serviks dilakukan di Laboratorium Parasitologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada, D.I.
Yogyakarta pada tanggal 13 hingga 24 Oktober 2014. Pengujian efek sitotoksik ini meliputi pembuatan media RPMI, pembuatan media kultur lengkap MK,
penumbuhan sel HeLa dan sel Vero, pembuatan larutan uji EEBA, dan uji sitotoksik EEBA terhadap sel HeLa dan sel Vero dengan menggunakan metode
MTT.
3.11 Penumbuhan Sel
3.11.1 Penumbuhan sel HeLa
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diambil 10 mL media RPMI pada tabung konikel, diambil ampul dari freezer -80
o
C atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, diambil suspensi sel dalam ampul,
dimasukkan tetes demi tetes kedalam media RPMI yang telah disiapkan, disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, dibuang supernatan dan tambahkan 4
mL MK RPMI dan resuspensi hingga homogen. Ditransfer masing-masing 2 mL ke dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 mL MK ke dalam masing-masingflask
kultur dan dihomogenkan. Dimati kondisi sel dengan menggunakan mikroskop inverted. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak
43 menggerombol pada bagian tertentu. Diberi identitas pada flask kultur, kemudian
simpan dalam inkubator CO
2
Doyle, dkk., 2000.
3.11.2 Penumbuhan sel Vero
Dipersiapkan alat dan dikondisikan bahan pada suhu ruangan. Seluruh pekerjaan dilakukan di dalam LAF. Aliquot 10 mL media M199 dimasukkan ke
dalam tabung konikel 15 mL, kemudian ampul yang berisi sel biakan diambil dari freezer -80
o
C atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar. Suspensi sel dalam ampul diambil, lalu dimasukkan tetes demi tetes kedalam media M199
yang telah disiapkan, disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang lalu tambahkan 4 mL MK-M199 dan resuspensi hingga homogen.
Ditransfer masing-masing 2 mL ke dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 mL MK ke dalam masing-masing flask kultur dan dihomogenkan. Diamati kondisi sel
dengan menggunakan mikroskop inverted. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian tertentu. Diberi
identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO
2
5 Doyle, dkk., 2000.
3.12 Subkultur Sel
3.12.1 Subkultur sel HeLa
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, dilakukan pengerjaan pada LAF. Dilakukan proses panen sel dengan cara mengambil 500
µ L panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Ditambahkan 6 mL MK- RPMI, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO
2
, diamati kondisi sel pada keesokan harinya Doyle, dkk., 2000.
