44
3.12.2 Subkultur sel Vero
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, dilakukan pengerjaan pada LAF. Dilakukan proses panen sel dengan cara mengambil 500
µ L panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Ditambahkan 6 mL MK- M199, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO
2
5, diamati kondisi sel pada keesokan harinya Doyle, dkk., 2000.
3.13 Panen Sel
3.13.1 Panen sel HeLa
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada ruangan dengan LAF. Dibuang MK-RPMI dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, dicuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS
Phosphate Buffer Saline, ditambahkan 400 µL tripsin - EDTA 0,25 secara merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
selama ± 5 menit dan ditambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Diresuspensi sel dengan
mikropipet agar sel terlepas satu-satu tidak menggerombol. Diamati keadaan sel di mikroskop inverted. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang
menggerombol. Ditransfer sel ke dalam tabung konikel Doyke, dkk., 2000.
3.13.2 Panen sel Vero
Dipersiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, diamati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada ruangan dengan LAF. Dibuang MK-M199 dari flask dengan mikropipet atau pipet pasteur, dicuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS
Phosphate Buffer Saline, ditambahkan 400 µ L tripsin - EDTA 0,25 secara
45 merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO
2
selama ± 5 menit dan ditambahkan 4 mL MK untuk menginaktifkan tripsin. Diresuspensi sel dengan
mikropipet agar sel terlepas satu-satu tidak menggerombol. Diamati keadaan sel di mikroskop inverted. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang
menggerombol lalu ditransfer sel ke dalam tabung konikel Doyke, dkk., 2000.
3.14 Penghitungan Sel HeLa dan Sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 µL panenan sel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Hitung jumlah sel di bawah
mikroskop dengan menggunakan counter. Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, Cdan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak Gambar 3.1.
Gambar 3.1 Hemositometer kamar hitung
Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap mati dan sel yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel di batas
kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumlah sel per mL dengan rumus: ∑selmL=
∑ sel A+ ∑ sel B+∑ sel C + ∑ sel D 4
×10
4
Hitung jumlah total sel yang diperlukan. Misalnya untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate, maka jumlah total sel yang diperlukan adalah
1x10
4
sumuran x 100 sumuran dibuat lebih = 1x10
6
sel
Kategori