Tempat dan Waktu Penelitian Pembuatan Ekstrak

30 evaporator Haake D1, sentrifugator, seperangkat alat destilasi, cawan porselen alas rata, krus porselen bertutup, desikator, tanur, vortex dan 96-well plate.

3.2.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah buah andaliman.

Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro analisis, yaitu : α-naftol, asam asetat anhidrida, asam asetat pekat, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzena, besi III klorida, kloralhidrat, bismut III nitrat, etanol 96, eter, etilasetat, n-heksana, hepes Sigma, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, petroleum eter, raksa II klorida, serbuk magnesium, serbuk zinkum, natrium hidrogen sulfat Macalai tesque, timbal II asetat, toluena, air suling, dimetil sulfoksida DMSO Sigma. Sel kanker serviks HeLa dan Vero yang merupakan koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM, Media Roswell Park Memorial Institute RPMI, media M- 199, Fetal Bovine Serum FBS 10 vv Gibco, penicillin -streptomisin 2 vv Gibco, dan Fungizon Amfoterisin B 0,5. Selain bahan-bahan di atas juga digunakan 0,25 tripsin – EDTA Gibco, Fetal Bovine Serum FBS 10 vv Gibco, Phospate Buffer Saline PBS, MTT [3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5 difeniltetrazolium bromida] Sigma, dengan konsentrasi 5 mgmL, natrium dodesil sulfat SDS dalam HCl 0,1 N.

3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan

3.3.1 Pengambilan bahan

Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah yang lain. Bahan tumbuhan yang digunakan 31 dalam penelitian ini adalah buah andaliman Zanthoxylum acanthopodium DC. yang diperoleh dari Pasar Sore, Jalan Jamin Ginting kelurahan Padang Bulan Kota Medan, Propinsi Sumatera Utara bulan Agustus 2014.

3.3.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi buah andaliman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI.

3.3.3 Pembuatan simplisia

Buah andaliman yang telah dikumpulkan dicuci bersih dengan air mengalir, ditiriskan kemudian ditimbang sebagai berat basah. Bahan ini kemudian dikeringkan di lemari pengering hingga kering, kemudian ditimbang sebagai berat kering. Bahan kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender. Simplisia dimasukkan dalam wadah plastik dan diikat, diberi etiket lalu disimpan pada tempat yang terlindung dari cahaya matahari.

3.4 Pembuatan Pereaksi

3.4.1 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, kemudian sebanyak 2 g iodium dilarutkan dalam larutan kalium iodida, setelah larut dicukupkan volume dengan air suling hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.2 Pereaksi Dragendorff

Sebanyak 8 g bismut III nitrat dilarutkan dalam 20 mL asam nitrat pekat. Pada wadah lain sebanyak 27,2 g kalium iodida dilarutkan dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. 32 Selanjutnya diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air suling hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.3 Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,3596 g raksa II klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 mL. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 mL air suling. Kemudian keduanya dicampur dan ditambahkan air suling hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.4 Pereaksi besi III klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.5 Pereaksi Molish

Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.6 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas CO 2 hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.7 Pereaksi asam klorida 1 N

Sebanyak 8,5 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.8 Pereaksi asam klorida 2 N

Sebanyak 17 mL asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 mL Depkes RI, 1995. 33

3.4.9 Pereaksi natrium hidroksida 1 N

Sebanyak 4,001 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.10 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL Depkes RI, 1995.

3.4.11 Pereaksi kloralhidrat

Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 mL air suling Depkes RI, 1995.

3.4.12 Pereaksi Liebermann-Burchard

Sebanyak 5 mL asam sulfat pekat dicampur dengan 50 mL etanol 96, kemudiandengan hati-hati 5 mL asam asetat anhidrida dimasukkan ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Depkes RI, 1995.

3.5 Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia dan Ekstrak

Skrining fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida antrakinon, saponin, tanindan steroidtriterpenoid.

3.5.1 Pemeriksaan alkaloid

Serbuk simplisia dan ekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 Ml asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a. 3 tetes larutan filtrat ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning. 34 b. 3 tetes larutan filtrat ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Bouchardat akan terbentuk endapan berwarna coklat-hitam. c. 3 tetes larutan filtrat ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Dragendorff akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga. Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga dari percobaan di atas Depkes RI, 1995.

3.5.2 Pemeriksaan flavonoid

Sebanyak 10 g serbuk simplisia dan ekstrak ditambahkan 10 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 mLfiltrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 mL asam klorida pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.5.3 Pemeriksaan glikosida

Serbuk simplisia dan ekstrak ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 mL campuran etanol 96 - air 7:3 dan 10 mL asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran kloroform - isopropanol 3:2 sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari ditambahkan natrium sulfat anhidrat, disaring, dan diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dengan 2 mL metanol. 35 Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: a. Diuapkan 0,1 mL larutan percobaan diatas penangas air, pada sisa ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard, terjadi warna biru atau hijau yang menunjukkan adanya glikosida. b. Dimasukkan 0,1 mL larutan percobaan dalam tabung reaksi, diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes pereaksi Molish. Ditambahkan hati-hati 2 mL asam sulfat pekat, terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan menunjukkan adanya ikatan gula Depkes RI,1995.

3.5.4 Pemeriksaan glikosida antrakinon

Serbuk simplisia dan ekstrak ditimbang sebanyak 0,2 g, kemudian ditambahkan 5 mL asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 mL benzena, dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan, dikocok dengan 2 mL NaOH 2 N, lalu didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes RI,1995.

3.5.5 Pemeriksaan saponin

Serbuk simplisia dan ekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1 - 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI,1995.

3.5.6 Pemeriksaan tannin

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dididihkan selama 3 menit dalam air suling lalu didinginkan dan disaring. 36 Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1 bv. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966.

3.5.7 Pemeriksaan steroidtriterpenoid

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 mLn- heksana selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan 20 tetesasam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann-Burchard, timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroid, sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpeniod Harborne, 1987.

3.6 Karakterisasi Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, pemeriksaan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu tidak larut asam Depkes RI, 1995.

3.6.1 Pemeriksaan makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, bau, rasa dan warnadari simplisia buah Andaliman Zanthoxylum acanthopodium DC.

3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukanterhadap serbuk simplisia buah Andaliman Zanthoxylum acanthopodium DC.. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan cover glass kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. 37

3.6.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 mL, alat penampung dan pendingin, tabung penyambung dan penerima 10 mL. Cara kerja: a. Penjenuhan toluena Sebanyak 200 mL toluen dan 2 mL air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. b. Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu yang berisi toluena jenuh tersebut, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen vb WHO, 1998.

3.6.4 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL air - kloroform 2,5 mL kloroform dalam air suling sampai 1 L dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, 38 kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 mL filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalampersen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan di udara, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 mL filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.6.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam

Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 mL asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan 39 dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.

3.7 Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi dengan pelarut etanol 96, sebanyak 300 gram serbuk simplisia buah andaliman dimasukkan ke dalam bejana tertutup, ditambahkan 2250 mL etanol 96, lalu bejana ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk. Setelah 5 hari maserat disaring. Ampas dicuci dengan pelarut etanol 96 secukupnya hingga diperoleh 3000 mL, lalu dipindahkan dalam bejana tertutup dan dibiarkkan ditempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari, kemudian dienaptuangkan dan disaring Depkes RI, 1979. Maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 50 o C sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak yang diperoleh 54,575 gram. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 17 , halaman 84.

3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas sitotoksik ini, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas dan plastik yang akan digunakan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Lay, 1994.

3.9 Pembuatan Media

3.9.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute RPMI

Komposisi: RPMI sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L- glutamine tanpa NaHCO 3 , netto 10,4 gram 40 Hepes 2 gram NaHCO 3 2 gram HCl 1N secukupnya NaOH 1N secukupnya Aquabides steril ad 1 liter Cara Pembuatan: Sebanyak 1 sachet RPMI, 2 gram Hepes dan 2 gram NaHCO 3 dimasukkan ke dalam erlenmeyer, ditambahkan 800 mL aquabides steril, dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet, kemudian pH diukur dengan pH meter pH yang diiinginkan adalah 7,2 - 7,4; karena terlalu basa maka digunakan HCl 1N untuk menyesuaikan pH. Kemudian ditambahkan aquabides steril sampai 1 L, dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum didalam LAF Laminar Air Flow, dipasang filter aparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media nama media, tanggal pembuatan, expire datedan nama pembuat, dan disimpan pada suhu 2 - 8 o C Sambrook, dkk., 1989.

3.9.2 Pembuatan media kultur lengkap MK-RPMI

Komposisi: Fetal Bovine Serum FBS 10 Penisilin-Streptomisin 2 Fungizon Amfoterisin B 0,5 RPMI ad 100 mL Cara Pembuatan: Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air Flow, beri identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat, simpan pada suhu 2 - 8 o C Sambrook, dkk., 1989.