kembali kadar glukosa darah dan hari ke-5 mulai diberikan EEAA 50 mgkgBB per oral. Setelah diberi perlakuan hingga hari ke-13, tikus diukur
kembali kadar glukosa darah dan berat badannya pada hari ke-7 dan14.
16. Pengumpulan sampel
Tikus yang akan digunakan untuk penelitian, dipuasakan terlebih dahulu dan ditimbang berat badannya sebelum diukur kadar glukosa darah. Pengambilan
darah dilakukan melalui plexus retroorbitalis pada mata, diambil darahnya dan diukur menggunakan mikrovitalab dengan metode enzimatik GOD-PAP hari ke-
0, 4, 7 dan 14. Pada hari ke-14, setelah ditimbang berat badan dan diukur kadar glukosa darah, tikus di bedah dan diambil pankreasnya untuk di amati gambaran
histologis pankreas tikus.
17. Pembuatan slide
a. Trimming adalah tahapan pemotongan tipis jaringan setebal kurang lebih 4
mm dengan orientasi sesuai dengan organ yang akan dipotong. Pisau yang digunakan untuk trimming adalah pisau skalpel No 22-24. Jumlah potongan
jaringan yang dapat dimuat dalam embedding cassete berkisar antara 1-5 buah disesuaikan dengan ukuran organ.
b. Dehidrasi
Dehidrasi jaringan yang dilakukan setelah trimming menggunakan tissue processor dan cairan dehidran. Cairan dehidran ini kemudian dibersihkan dari
dalam jaringan dengan menggunakan reagen pembersih. Reagen pembersih ini akan diganti dengan parafin dengan cara penetrasi ke dalam jaringan
impregnasi. Parafin yang digunakan mempunyai titik cair 56-58
o
C. Cairan dalam tissue processor sebaiknya diganti tiap seminggu sekali.
Pengaturan waktu dehidrasi adalah sebagai berikut:
Proses Cairan
Waktu Dehidrasi
Alkohol 80 2 jam
Alkohol 95 2 jam
Alkohol 95 1 jam
Alkohol absolut 1 jam
Alkohol absolut 1 jam
Clearing Xylol
1 jam Xylol
1 jam
Impregnasi
Parafin 2 jam
Parafin 2 jam
c. Embedding
Setelah melakukan dehidrasi, maka jaringan yang berada dalam embedding cassette dipindahkan ke dalam base mold, kemudian diisi parafin cair. Setelah
itu, diletakkan pada balok kayu ukuran 3x3 cm. Jaringan yang diletakkan pada balok kayu disebut blok.
d. Cutting
Proses cutting menggunakan mikrotom. Pisau yang tajam akan menghasilkan hitologis yang baik, yang secara mikroskopis ditandai dengan tidak adanya
artefak berupa goresan vertikal maupun horisontal. 1
Orientasi blok pada mikrotom Blok diletakkan sejajar memanjang dengan pisau, untuk jaringan yang
keras harus diletakkan dibagian atas. Disediakan cukup ruangan antara jaringan dengan tepi blok untuk memudahkan pemisahan jaringan. Perlu
diperhatikan ketajaman pisau sehingga diperoleh hasil pemotongan yang rata dan tidak berkerut.
2 Soaking dan Icing
Jaringan dilembabkan dengan menempelkan kapas basah pada permukaan blok dan digunakan air es untuk menjaga suhu blok dan pisau tetap sama.
3 Mengambangkan lembaran potongan jaringan
Lembaran potongan jaringan diapungkan dengan meletakkan salah satu ujung potongan di atas permukaan air dalam waterbath. Untuk
menghilangkan kerutan jaringan dapat dilakukan dengan menekan salah satu sisi dan potongan jaringan dengan menggunakan ujung jari dan sisi
lain ditarik dengan menggunakan kuas kecil. 4
Pemisahan rangkaian lembaran jaringan Menggunakan pemisah jaringan yang dipanaskan.
5 Pengambilan ribbon dengan slide
Diambil lembaran jaringan dengan memasukkan slide bersih secara diagonal ke dalam waterbath gerakan menyendok dan spesimen jaringan
diletakkan tepat di tengah slide. Perlu diperhatikan agar tidak terdapat gelembung udara di bawah jaringan.
e. Staining Pewarnaan
Untuk pemeriksaan, dipergunakan teknik pewarnaan HE. Adapun prosedur pewarnaan Harris Hematoxyline-Eosin dapat dilihat pada tabel VI sebagai
berikut:
Tabel VI. Prosedur pewarnaan Harris Hematoxyline-Eosin No
Cairan Waktu
1 Xylol I
5 menit 2
Xylol II 5 menit
3 Xylol III
5 menit 4
Alkohol absolut I 5 menit
5 Alkohol absolut II
5 menit 6
Aquadest 1 menit
7 Harris-Hematoxyline
20 menit 8
Aquadest 1 menit
9 Acid alkohol
2-3 celupan 10 Aquadest
1 menit 11 Aquadest
15 menit 12 Eosin
2 menit 13 Alkohol 96 I
3 menit 14 Alkohol 96 II
3 menit 15 Alkohol absolut I
3 menit 16 Alkohol absolut II
3 menit 17 Xylol IV
5 menit 18 Xylol V
5 menit f.
Mounting Setelah jaringan pada slide diwarnai, dilakukan mounting dengan cara
meneteskan bahan mounting DPX, Entelan, Canada balsam sesuai kebutuhan dan ditutup dengan gelas penutup.
g. Pembacaan slide dengan mikroskop
Slide diperiksa di bawah mikroskop sinar. Semua lesi pada pankreas dicatat dan selanjutnya diinterpretasikan. Berdasarkan hasil pembacaan gambaran
histologis pankreas dapat tingkat keparahan dibagi menjadi 3, yaitu: +
= tingkat keparahan ringan ++
= tingkat keparahan sedang +++
= tingkat keparahan berat
F. Tata Cara Analisis Hasil
