4.2. Pembahasan
4.2.1. Hasil Ekstraksi Galaktomanan Dari Kolang-Kaling Pada Kondisi Netral
Ekstraksi galaktomanan dari kolang-kaling pada kondisi netral dilakukan dengan beberapa variasi. Pada variasi volume pelarut air, galaktomanan yang
paling banyak diperoleh pada volume 300 mL yaitu 0,869 gram dan pada volume 250 mL adalah 0,866 gram. Galaktomanan yang diperoleh diantara kedua volume
pelarut tersebut hanya berbeda sedikit dan pertimbangan penggunaan alkohol perbandingan alkohol : ekstrak kolang-kaling = 2:1 sebagai pelarut pada proses
pengendapan galaktomanan maka untuk variasi berikutnya digunakan volume pelarut sebesar 250 mL, agar dapat mengurangi pemakaian alkohol. Berikutnya
dilakukan variasi kecepatan sentrifugasi, pada variasi kecepatan sentrifugasi galaktomanan yang diperoleh paling banyak pada kecepatan 9500 rpm dan variasi
waktu selama 15 menit. Grafiknya dapat dilihat pada gambar 4.6.
Gambar 4.6. Grafik Ekstraksi Galaktomanan Pada Kondisi Netral
Proses ekstraksi pada kondisi netral, metodenya lebih sederhana, tidak membutuhkan pemurnian lanjutan, mencegah penggunaan pelarut organik selain
0,697 0,812
0,866 0,869
0,865 0,858
0,866 0,867
0,912 0,91
0,804 0,915
0,912 0,913
0,914
0,6 0,65
0,7 0,75
0,8 0,85
0,9 0,95
1
1 2
3 4
5
B er
at G
al ak
tom an
an g
Variasi pelarut, Kecepatan sentrifugasi, Waktu
Variasi Volume Pelarut mL; 150; 200; 250; 300;
350
Variasi Kecepatan Sentrifugasi rpm; 8000;
8500; 9000; 9500; 10.000
Variasi Waktu Menit; 10; 15; 20; 25; 30
Universitas Sumatera Utara
alkohol dan dapat menghasilkan bahan dengan kualitas dapat dimakan serta ramah lingkungan Cerquiera
et al., 2009c. Secara umum galaktomanan gum digunakan pada industri farmasi dan kosmetik tanpa pemurnian Uner
and
Altinkurt, 2004. Proses ekstraksi galaktomanan dalam kondisi netral dengan
perolehan galaktomanan yang optimum pada berbagai variasi antara lain: perbandingan kolang-kaling dan volume pelarut air suling sebesar 1: 12,5;
kecepatan sentrifugasi 9500 rpm, waktu selama 15 menit. Untuk pengendapan digunakan alkohol dengan perbandingan antara ekstrak kolang-kaling dan alkohol
adalah 1: 2. Pada kondisi netral diperoleh persentase galaktomanan sebesar 4,58 dan tidak jauh berbeda dengan yang diperoleh oleh Koiman pada kondisi basa
menggunakan kolang-kaling yang telah dikalengkan yakni sekitar 5 Koiman, 1971. Serbuk galaktomanan kolang-kaling yang diperoleh lebih putih lampiran
1 sehingga dapat digunakan secara langsung dalam pembuatan edible film.
Galaktomanan yang diperoleh dianalisis bentuk morfologi permukaannya dengan SEM, hasilnya menunjukkan bahwa bentuk morfologi permukaan
galaktomanan kolang-kaling mirip dengan morfologi permukaan galaktomanan dari
guar gum Prashanth et al., 2006 lampiran 6. Bentuk partikelnya yang tidak teratur, berbentuk gerombol yang ukurannya bervariasi dan juga ada
rongga dipermukaan yang sedikit kasar. Differential Thermal Analysis DTA adalah suatu teknik di mana suhu dari suatu
sampel dibandingkan dengan material inert. Suhu dari sampel dan pembanding pada awalnya sama sampai ada kejadian yang mengakibatkan perubahan suhu
seperti pelelehan, penguraian, atau perubahan struktur kristal sehingga suhu pada sampel berbeda dengan pembanding. Bila suhu sampel lebih tinggi dari pada suhu
pembanding maka perubahan yang terjadi adalah eksotermal, dan endotermal bila sebaliknya West, 1984. Ketika suhu masih rendah, belum terjadi perubahan
kondisi operasional alat. Pada suhu tertentu, pada awalnya mulai terjadi perubahan dimana terjadi pelepasan H
2
O sehingga suhu sampel lebih rendah dari suhu pembanding maka dihasilkan puncak kekanan endotermal dan terbaca oleh
DTA sebagai titik belok kurva. Semakin tinggi suhu di dalam pemanas, terjadi peruraian degradasi pada galaktomanan dan mengakibatkan perbedaan suhu
Universitas Sumatera Utara
dengan pembanding bertambah tinggi dan puncak kekiri eksotermal. Perbedaan ini semakin meningkat sampai suhu tertentu di mana degradasi telah mencapai
aktivitas maskimumnya yang ditunjukkan oleh titik puncak. Berdasarkan analisis sifat termal galaktomanan kolang-kaling yang
diekstraksi pada kondisi netral, suhu endotermal puncak yang dihasilkan ke kanan terjadi pelepasan H
2
O pada suhu 85℃ dan 270℃.Suhu eksotermal puncak yang dihasilkan kekiri terjadinya degradasi senyawa galaktomanan pada
suhu 440℃ lampiran 2. Dekomposisi termal sampel juga berhubungan dengan berat molekul sampel, tingkat polimerisasi dan percabangan Riande
et al., 2000; Sperling, 2006. Semakin meningkat kandungan manosa pada sampel
menunjukkan ikatan rantai cabang lebih rendah dan energi ikatan rantai utama monosakarida lebih tinggi maka energi juga dibutuhkan lebih besar Na
and Lee, 1997.
Bila dibandingkan
galaktomanan kolang-kaling
perbandingan monosakaridagalaktosa
= 1,331
dan A.
paponina perbandingan
manosagalaktosa = 1,35 hampir sama, suhu endotermal A. paponinajuga terjadi
dua kali Cerquiera et al., 2011, hal ini juga sama dengan yang dinyatakan oleh
peneliti sebelumnya bahwa galaktomanan mengalami keadaan endotermal mendekati suhu 100℃ Vandrescolo
et al., 2009, puncak pertama pada suhu 117,64 - 119,71℃ dan kedua pada suhu 306,59 - 345,56℃ Chaires
et al., 2008. Galaktomanan kolang-kaling suhu endotermalnya terjadi dua kali yaitu puncak
pertama pada suhu 85℃ dan kedua pada suhu 270℃,yang menyatakan bahwa terjadi dua kali penguapan air dari polimer galaktomanan, ini menunjukkan
bahwa pelepasan air dari polimer sulit, karena adanya gugus fungsi OH yang bersifat hidrofilik yang memungkinkan adanya interaksi yang kuat dengan H
2
O. Puncak yang paling tinggi terdapat pada suhu transisi eksotermal 440℃, dimana
pada suhu tersebut terjadi dekomposisi secara eksotermal. Suhu eksotermal galaktomanan kolang-kaling lebih tinggi dari LBG 300℃ galaktomanan LBG
terdekomposisi diatas suhu 300℃Aydinli et al., 2003, ini menunjukkan bahwa
tidak terjadi dekomposisi galaktomanan kolang-kaling hingga suhu 440℃ sehingga aman digunakanan untuk produk makanan yang diolah pada suhu tinggi.
Universitas Sumatera Utara
Galaktomanan yang dianalisis dengan spektrofotometer FT-IR lampiran 3 menghasilkan puncak-puncak serapan pada bilangan gelombang 3425 cm
-1 ,
menunjukkan adanya vibrasi stretching gugus O-H. Puncak 810 dan 871 cm
-1
literatur 815 dan 872 cm
-1
berhubungan dengan adanya konfigurasi anomer konformer
α dan
β dan ikatan glikosidik yang dicirikan oleh unit
α -D-
galaktopiranosa dan unit β
-D- manopiranosa. Pita lebar antara 1080 cm
-1
dan 1016cm
-1
merupakan vibrasi stretching C-O pada ikatan C-OH dan C-O-C misalnya : glikosidik. Puncak pada 1150 cm
-1
literatur 1152 cm
-1
merupakan vibrasi bending C-O, yang menunjukkan adanya cincin piranosa. Puncak lebar
antara 1134-983 cm
-1
adalah merupakan karakteristik bending C-OH Fiqueiro et
al., 2004; Prasanth et al., 2006. Puncak pada bilangan gelombang 2974 merupakan vibrasi stretching C-H sp
3
yang didukung oleh vibrasi bending pada bilangan gelombang 1419 cm
-1
. Pita lebar antara 2800-3000 cm
-1
dan 3100-3500 cm
-1
menunjukkan vibrasi stretching C-H dan O-H Yuen et al., 2009. Puncak
pada bilangan gelombang 1635 cm
-1
menunjukkan adanya ikatan antara polisakarida dengan air Xiao
et al, 2012 ; Tong et al., 2009, puncak ini juga merupakan vibrasi bending scissoring ikatan OH yang menyerap molekul air.
Telah diteliti pada guar gum alami atau tanpa modifikasi memberikan puncak serapan pada 1652 cm
-1
yang merupakan vibrasi bending scissoring ikatan OH yang menyerap molekul air Gong,
et all., 2012. Analisis Galaktomanan dengan spektrofotometer NMR sedikit sulit
berhubung kelarutan galaktomanan dalam air rendah dan viskositasnya besar sehingga larutannya kental, dengan demikian puncak yang dihasilkan rendah.
Galaktomanan yang dianalisis dengan spektrofotometer
1
H-NMR menunjukkan pergeseran kimia proton unit manosa dan galaktosa, dimana untuk mengetahui
proporsional antara residu galaktosa dan manosa dapat digunakan dengan melihat perbandingan integral proton C anomer galaktosa dan manosa Muchin
and Yoshida, 2012. Hasil analisis galaktomanan kolang-kaling dengan spektrofotometer
1
H-NMR menunjukkan pergeseran kimia proton anomer galaktosa pada 5,57 ppm dengan integral 1 dan anomer manosa pada 5,28 ppm
dengan integral 1,331. Untuk itu perbandingan residu galaktosa dan manosa pada
Universitas Sumatera Utara
polisakarida galaktomanan kolang-kaling adalah 1:1,331 hampir sama dengan galaktomanan dari tumbuhan kacang-kacangan yaitu perbandingannya 1,0:1,04-
1,20 Ramesh et al., 2001. Perbandingan galaktosa dan manosa pada
galaktomanan kolang-kaling yang diperoleh berbeda dengan yang diperoleh peneliti sebelumnya dimana perbandingan yang diperolehnya adalah 1:2,26,
dimana perbandingan ini diperoleh berdasarkan analisis secara kimia dengan metode metilasi galaktomanan dari kolang-kaling yang telah dikalengkan
Kooiman, 1971. Data spektrum
13
C-NMR galaktomanan kolang-kaling Tabel 4.5 dapat diketahui bahwa ada perbedaan pergeseran kimia antara residu galaktosa dengan
galaktosa bebas dimana terjadi pergeseran kimia kearah down field untuk C-1 +
6,22, ini disebabkan karena adanya efek α
yang mengindikasikan bahwa atom C- 1 residu galaktosa terlibat dalam pembentukan ikatan galaktosida, harga
pergeseran ini merupakan konfigurasi α
pada pusat anomer dari galaktosa. Pergeseran kimia untuk atom C-6 pada residu galaktosa tidak jauh berbeda bila
dibandingkan dengan galaktosa bebas, ini menunjukkan bahwa tidak ada terdapat substituen pada atom tersebut. Pergeseran kimia untuk C-6 62,07 ppm dan tidak
adanya puncak pada daerah 63-64 ppm menunjukkan bahwa polisakarida mengandung residu galaktosa dalam bentuk piranosa Egorov
et al., 2004; Smirnova
et al., 2004 dan Vieiera et al., 2007. Bila kita lihat posisi-posisi puncak atom karbon pada residu manosa dan
β-D-manopiranosida, dapat diketahui bahwa puncak C-1, C-4 dan C-6 pada 1,4- di-O-β-D-manopiranosil yang terikat HO-6 bergeser kearah
down field. Jadi C- 1, C-4 dan C-6 pada residu manosa terlibat dalam pembentukan ikatan kovalen .
Posisi puncak C-6 pada 67,40 ppm dan tidak adanya puncak antara 63-64 ppm, menunjukkan residu manosa pada polimer tersebut dalam bentuk piranosa.
Pergeseran kimia puncak C-6 yang tersubstitusi pada residu manopiranosa menunjukkan substitusinya dengan
α -anomer misalnya galaktosa, karena dalam
hal ini glikosilasi dengan α
-anomer pergeseran kimianya harus lebih kecil dari 70 ppm. Dari data diatas bersamaan dengan keterlibatan atom C-1 residu galaktosa
Universitas Sumatera Utara
pada pembentukan ikatan kimia antara dua monomer D-galaktosa dan D-manosa, merupakan petunjuk untuk heteropolisakarida alami galaktomanan. Pergeseran
kimia puncak atom C-1 dan C-4 pada residu manopiranosa kearah down field
menunjukkan residu manopiranosa terikat satu dengan lainnya pada posisi tersebut, membentuk rantai 1,4-β-D-manopiranosa Egorov
et al., 2004; Smirnova
et al., 2004 dan Vieiera et al., 2007. Hal ini didukung oleh spektrum FT-IR galaktomanan yang menunjukkan adanya anomer
α dan
β tetapi
kelimpahan relatif untuk masing-masing monomer tersebut tidak dapat diperoleh dari spektrum
13
C-NMR karena puncak yang dihasilkan terlalu rendah dan nois.
Adapun struktur yang diperoleh sama dengan yang terdapat pada literatur, seperti pada gambar 4.7 dibawah ini.
Gambar 4.7. Struktur galaktomanan Moreira, 2008.
Analisis komponen kimia hasil ekstraksi kolang-kaling adalah protein 0,261, lemak 0,101, serat kasar 8,050 dan galaktomanan 90,570.
Komponen serat kasar merupakan serat yang larut dalam air yang dapat berfungsi untuk mengontrol diabetes dan mengurangi kolesterol dalam darah Schauss
and Voon, 2006 serat terlarut juga telah digunakan sebagai pengental,
stabilizer emulsi dan zat aditif pada berbagai industri makanan dan obat-obatan Reid
and edwards, 1995; Chandrasekaran
et al., 1998; Mikkonen et al., 2009. Karbohidrat merupakan komponen kimia yang terbesar dan lemak, protein merupakan
komponen minor, Ketiga komponen tersebut merupakan bahan dasar dalam pembuatan
edible film, sehingga tanpa pemisahan masing-masing komponen,
Universitas Sumatera Utara
galaktomanan tersebut sudah dapat digunakan sebagai bahan dasar dalam pembuatan
edible film hal ini juga didukung oleh warna galaktomanan yang diperoleh berwarna putih.
4.2.1.1. Hasil Studi Analisis Sifat Antioksidan Galaktomanan. Pengukuran sifat antioksidan dengan metode DPPH• menunjukkan bahwa
semakin tinggi konsentrasi galaktomanan yang digunakan maka inhibisinya semakin tinggi gambar 4.9. Dari data pengukuran absorbansi maka diperolehlah
harga inhibisi, dengan menggunakan persamaan garis regresi diperoleh nilai IC
50
sebesar 22,109 mgmL, artinya dibutuhkan konsentrasi galaktomanan sebanyak 22,109 mgmL untuk dapat menyebabkan daya hambatnya 50
terhadap oksidasi Cerquira et al., 2010a. Sifat aktivitas antioksidan
galaktomanan kolang-kaling lebih lemah dari vitamin C IC
50
= 9-10 ppm, demikian juga aktivitas antioksidan galaktomanan kolang-kaling lebih rendah dari
aktivitas antioksidan polisakarida yang berasal dari Ganoderma lucidum, dimana
untuk Ganoderma lucidum bila konsentrasi 2-2,6 mgmL aktivitas antioksidanya
lebih tinggi dari vitamin C Xiao Ping et al., 2009. Polisakarida lain yang
memiliki aktivitas antioksidan lebih besar dari galaktomanan kolang-kaling adalah polisakarida kulit buah
Russula virescens Suns et al., 2010, polisakarida Lugisticum chuanxiong Hort pada 3mgmL inhibisinya 38,1-74,8 Yuan et
al., 2008. Demikian juga sifat antioksidan galaktomanan guar gum bila diukur
dengan metode DPPH• memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi bila
dibandingkan dengan galaktomanan kolang-kaling, dimana pada konsentrasi 2 mgmL inhibisinya = 40 Wang
et al., 2010 sedangkan galaktomanan kolang-kaling 16,41 Gambar 4.9.
DPPH• sangat bermanfaat dalam menentukan sifat penangkapan radikal
terhadap bahan karena dekomposisinya hanya sedikit, tidak membentuk dimer karena tidak bereaksi dengan oksigen Yu
et al., 2009a dan Yu et al., 2009b.
Metode DPPH• didasarkan pada reduksi senyawa DPPH• dimana DPPH•
memiliki satu radikal bebas dengan elektron ganjil yang dalam larutan etanol
Universitas Sumatera Utara
berwarna ungu, dimana dapat memberikan absorbsi maksimum pada panjang gelombang 517 nm pada spektrofotometer ultraviolet UV.
Gambar 4.8. Grafik Hasil Pengukuran Inhibisi Galaktomanan Kolang- kaling Dengan Metode DPPH•.
Radikal pada DPPH• akan menjadi berpasangan dengan adanya donor dari hidrogen atau elektron sehingga warna berubah menjadi kuning yang
mengakibatkan kekuatan absorbsi menjadi menurun Blois, 1958. Adapun struktur kestabilan radikal bebas DPPH• adalah seperti gambar dibawah ini.
N N O
2
N
O
2
N NO
2
N
+
C N
-
O
2
N
O
2
N NO
2
H N N
O
2
N
O
2
N NO
2
... .
Ada pun reaksi yang terjadi pada DPPH• adalah reduksi oleh antioksidan AH atau reaksi dengan spesies radikal R•. Reaksinya adalah sebagai berikut Brand-
William et al.,1995:
DPPH•
ungu
+ AH DPPH-H
kuning
+ A• DPPH• + R• DPPH-R
16,41 18,14
21,42 22,2
22,99 y = 1,9371x + 7,1743
R² = 0,7043
5 10
15 20
25 30
2 4
6 8
10 12
In h
ib is
i
Konsentrasi Galaktomanan mgmL
Linear Persamaan Garis Regresi
Universitas Sumatera Utara
Secara umum reaksi terjadi secara homolitik dimana DPPH• akan memutus ikatan H-X X= C, O, N, S, Cl, Br seperti hidrokarbon, alkohol, phenol, thiol,
amina, enol, hidroksilamin, N-alkoksinitroanilina Ionita, 2005. Mekanisme reaksi polisakarida dapat bertindak sebagai antioksidan
memang sampai dengan saat ini belum dengan jelas ditetapkan. Namun demikian ada beberapa peneliti yang telah memberikan saran mekanisme yang mungkin
terjadi dalam reaksi oksidasi tersebut. Beberapa peneliti menyatakan bahwa secara umum dalam teori radikal bebas ada 2 mekanisme kerja antioksidan yakni
penangkapan radikal bebas yang dihasilkan dan peredaman pembentukan radikal bebas. Dalam mekanisme penangkapan radikal bebas, polisakarida bertindak
sebagai donor atom hidrogen dimana hal ini terjadi oleh karena lemahnya energi disosiasi ikatan O-H. Radikal bebas akan menerima elektron tersebut membentuk
produk yang lebih stabil sehingga radikal bebasnya menjadi hilang dan reaksi berantainya menjadi terhenti Yamashoji
and Kajimoto, 1980; Yin et al., 2010; Lan
et. al., 2012, Jin et al., 2012. Oleh karena itu apabila semakin banyak gugus yang dapat menyumbangkan elektron seperti misalnya gugus hidroksil dan
karboksil pada polisakarida serta energi disosiasi ikatan O-H semakin lemah maka aktivitas antioksidannya semakin tinggi Shimada
et al, 1996; Yuan et al., 2005.
Peneliti lainnya menyatakan bahwa atom H yang terikat pada C anomer mudah lepas oleh adanya radikal OH● Fray, 1998. Penelitian pada selubiosa
memperlihatkan bahwa apabila terjadi abstraksi atom H pada atom C
1
, C
4
atau C
5
akan terjadi pemecahan ikatan glikosidik sedangkan bila abstraksi atom H terjadi pada atom C
2
, C
3
atau C
6
akan menghasilkan residu glikosulosa yang lebih stabil Schuchmann
and von Sonntag, 1978; Kardosova and Machova, 2006. Yamaguci et al., 2000 mengusulkan kemungkinan mekanisme polisakarida melibatkan
donasi hidrogen untuk memutus rantai reaksi dan penangkap radikal dapat mengabstraksi hidrogen anomer dari unit monosakarida internal pada
polisakarida. Berdasarkan keterangan diatas maka studi reaksi antara DPPH• dan galaktomanan kemungkinannya adalah sebagai berikut:
Universitas Sumatera Utara
DPPH.
+
O O
OH OH
O H
OH O
O O
O H
OH O
. O
H O
H OH
. H
n Galaktomanan
. .
H
DPPH-H
+
Radikal galaktomanan
O O
OH OH
OH O
O O
O H
OH O
. O
H O
H OH
. H
O H
n
.
Radikal galaktomanan akan mengalami pemutusan ikatan glikosidik yang mungkin menghasilkan lakton.
Universitas Sumatera Utara
Radikal galaktomanan
O O
OH OH
OH O
O O
O H
OH O
. O
H O
H OH
. O
H
n
.
O OH
OH
OH O
O C
O O
H OH
O .
O H
+
O O
H O
H OH
.
.
+
O O
H O
H OH
.
. DPPH.
O O
H O
H OH
.
DPPH.
Gambar 4.9. Reaksi DPPH• Dengan Galaktomanan
4.2.2. Hasil Isolasi Minyak Atsiri Daun Kemangi MADK Dengan Metode Hidrodestilasi.