Gugus fungsi khas kolagen terakhir adalah amida III yang ditunjukkan pada wilayah serapan 1229
1301 cm
-1
yang menunjukkan CN sterching dan NH bending Kong dan Yu 2007. Hal ini ditunjukkan pada serapan = 1240,49 cm
-1
untuk kolagen dan = 1240,39 cm
-1
untuk nanopartikel kolagen. Muyonga et al. 2004b menyatakan bahwa intensitas amida III berkaitan dengan struktur triple
heliks. Hal ini berarti bahwa kolagen yang dihasilkan dengan proses ekstraksi kulit dengan air pada suhu 40
C belum terdegradasi menjadi bentuk gelatin yang ditandai dengan masih terdapatnya struktur triple heliks.
Spektra infrared kolagen juga menunjukkan serapan pada bilangan gelombang 1163,89; 1081,19; 1032,21 cm
-1
dan nanopartikel kolagen pada bilangan gelombang 1082,25 dan 1031,89 cm
-1
. Petibois et al. 2006 mengatakan
serapan pada daerah bilangan gelombang tersebut menunjukkan vibrasi streching C-OH karbohidrat yang berikatan dengan protein kolagen. Hal ini menunjukkan
bahwa kolagen dan nanopartikel kolagen mengandung karbohidrat. Friess 1998
mengatakan bahwa kolagen tipe I tergolong glikoprotein dengan kandungan karbohidrat tidak lebih dari 1. Karbohidrat penyusun kolagen terdiri dari
galaktosa tunggal dan disakarida galaktosa dengan glukosa O-glycosidically.
4.4.4 Penentuan berat molekul dengan SDS ‐PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis SDS ‐PAGE
merupakan salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisis campuran protein secara kualitatif. Prinsip analisis SDS-PAGE adalah pemisahan
protein berdasarkan berat molekul. Metode ini menggunakan 2 macam gel, yaitu gel penahan stacking gel dan gel pemisah resolving gel. Penambahan deterjen
anionik, misalnya SDS sodium dodesil sulfat , -merkaptoetanol ke dalam gel
tersebut dan pada proses pemanasan akan merusak struktur tiga dimensi protein. -merkaptoetanol akan memecah ikatan disulfida dan mereduksinya menjadi
gugus sulfihidril, sedangkan SDS akan bereaksi dengan protein membentuk kompleks bermuatan negatif sehingga protein akan bergerak dalam medan listrik
hanya berdasarkan pada ukuran molekul. Protein berukuran kecil akan bergerak lebih cepat melintasi gel dibandingkan protein berukuran lebih besar sehingga
protein dengan berat molekul rendah memiliki jarak tempuh Rf yang lebih panjang dibandingkan protein dengan berat molekul tinggi Rosenberg 1996.
Proses elektroforesis dilakukan pada voltase 220 volt dan arus 50 mA selama 2 jam. Pola elektroforesis SDS-PAGE dari marker, kolagen, dan
nanopartikel kolagen ditunjukan pada Gambar 12. Berdasarkan pola elektroforesis terlihat bahwa baik kolagen maupun nanopartikel kolagen mengandung dua
rantai α yaitu rantai α1 dan α2. Kolagen maupun nanopartikel kolagen juga
mengandung komponen dengan berat molekul tinggi high molecular weight yang meliputi komponen
α chain dimers dan α chain trimers. Keberadaan komponen dan
menunjukkan adanya ikatan silang cross-linked dalam molekul kolagen. Friess 1998 mengatakan bahwa kolagen tipe I dicirikan
dengan adanya ikatan α1I
2
α2I dan trimer α 1I
3
. Hal ini berarti bahwa kolagen maupun nanopartikel kolagen yang dihasilkan tergolong kolagen tipe I.
Pola elektroporesis SDS-PAGE yang hampir sama juga ditunjukkan pada kolagen dari kulit beberapa spesies ikan, misalnya unicorn leatherjacket Aluterus
monocerous, largefin longbarbel catfish Mystus macropterus, striped catfish Pangasianodon hypophthalmus, balloon fish Diodon holocanthus dan ornate
threadfin bream Nemipterus hexodon Ahmad dan Benjakul 2010; Zhang et al. 2009; Singh et al. 2011; Huang et al. 2011; Nalinanon et al. 2011.
Gambar 12 Pola elektroforesis SDS-PAGE dari: marker M kolagen A dan
nanopartikel kolagen B.
Berat molekul untuk masing-masing pita rantai yang terdeteksi pada kolagen maupun nanopartikel kolagen dihitung berdasarkan berat molekul dari
marker spektra multicolor broad range protein ladder dari permentos Lampiran
M A
B 260 kDa
140 kDa 100 kDa
70 kDa 50 kDa
α1 α2
15. Berat molekul pita rantai α1, α2, , dan dari kolagen dan nanopartikel
kolagen ditunjukkan pada Tabel 13. Berat molekul rantai α1, α2 dan dari
kolagen dan nanopartikel kolagen hampir sama dengan berat molekul α1
120 kDa, α2 112 kDa dan 205 kDa pada kolagen dari kulit bluefin tuna
Thunnus orientails serta α1 117,3 kDa dan α2 107,4 kDa pada kolagen tipe I
dari sisik ikan karper Sung-Hee et al. 2011; Zhang et al. 2011. Tabel 13 Berat molekul kolagen dan nanopartikel kolagen dari kulit ikan pari
Sampel Berat molekul kDa
α1 αβ
Kolagen 132,35
113,72 207,33
294,31 Nanopartikel kolagen
125,70 108,17
187,58 279,94
Berdasarkan pola elektroforesis SDS-PAGE kolagen dan nanopartikel kolagen Gambar 12 dapat dilihat bahwa baik kolagen maupun nanopartikel
kolagen tidak mengandung komponen dengan berat molekul lebih rendah dari berat molekul
α2. Hal ini menunjukkan bahwa kolagen yang dihasilkan dengan proses ekstraksi kulit dengan air pada suhu 40
C belum terdegradasi menjadi bentuk gelatin. Karim dan Bhat 2009 menyatakan bahwa gelatin mengandung
campuran komponen dengan berat molekul berkisar dari 80 250 kDa. Hasil
penelitian Duan et al. 2011 menunjukkan bahwa gelatin dari kulit ikan mas Cyprinus carpio mengandung komponen dengan berat molekul berkisar dari
97 205 kDa. Hasil penelitian Nur Azira et al. 2012 menunjukkan bahwa gelatin
babi komersial mengandung komponen dengan berat molekul sebesar 58, 64, 70, 76, 83, 87, 96, 106, 114, 120, dan 125 kDa.
4.4.5 pH
Pengukuran pH dilakukan untuk menilai tingkat keasaman atau kebasaan suatu larutan. Nilai pH kolagen penting diketahui karena berkaitan erat dengan
tingkat kelarutan kolagen Tabarestani et al. 2012. Hasil pengukuran pH kolagen dan nanopartikel kolagen menunjukkan kedua bahan tersebut bersifat asam
dengan nilai pH berturut turut 5,00 dan 4,93 Tabel 14, namun nilainya masih
sedikit lebih tinggi dari pH kolagen beberapa merk kolagen untuk kosmetik yang dilaporkan Peng et al. 2004 yaitu berkisar antara 3,8
4,7. Tabel 14 Sifat fisik kolagen dan nanopartikel kolagen
parameter Kolagen
Nanopartikel kolagen Titik leleh
o
C 165,88
156,63 Viskositas cP
292,33 110,00
Derajat putih 72,48
60,03 pH
5,00 4,93
Perbedaan pH akhir kolagen tersebut dapat disebabkan perbedaan jenis dan konsentrasi asam atau basa yang digunakan selama perendaman. Proses asam
cenderung menghasilkan nilai pH rendah dan sebaliknya proses basa akan cenderung menghasilkan nilai pH yang tinggi. Kombinasi proses asam dan basa
cenderung menghasilkan pH mendekati netral Zhou dan Regenstein 2005. Proses penetralan juga akan mempengaruhi pH akhir kolagen karena proses
tersebut dapat mengurangi sisa-sisa asam maupun basa setelah perendaman. Proses penetralan yang baik menghasilkan pH akhir yang mendekati pH netral
Hinterwaldner 1977.
4.4.6 Viskositas
Viskositas atau kekentalan cairan menunjukkan ukuran ketahanan sebuah cairan terhadap perubahan bentuk ketika dikenai gaya. Viskositas juga dapat
diartikan sebagai sifat cairan yang menentukan besarnya perlawanan terhadap gaya geser. Beberapa faktor yang mempengaruhi tingginya viskositas antara lain
temperatur, gaya tarik antar molekul, dan jumlah molekul terlarut. Pengukuran viskositas kolagen dilakukan untuk mengetahui tingkat
kekentalan kolagen sebagai larutan pada konsentrasi dan suhu tertentu. Nilai viskositas kolagen maupun nanopartikel kolagen yang diukur menggunakan
viskometer Brookfield LV pada konsentrasi 1 dan suhu 30 C berturut-turut
adalah 292,33 cP dan 110,00 cP Tabel 14. Nilai viskositas kolagen dan nanopartikel kolagen cukup tinggi dibandingkan nilai viskositas Pepsin Soluble
Collagen PSC dari kulit ikan unicorn leatherjacket Aluterus monocerous yang berkisar antara 19,6
22,8 cP pada suhu sistem 4 C Ahmad dan Benjakul 2010.
