3 METODE
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2011 hingga September 2012. Ekstraksi kolagen dilakukan di Laboratorium Pengujian Mutu Hasil
Perikanan, Politeknik Negeri Pontianak; pembuatan nanopartikel kolagen dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi
Hasil Perairan IPB; analisis logam berat di Balai Riset dan Standarisasi Industri Pontianak; analisis ukuran partikel dengan Particle Size Analyzer PSA di
Laboratorium Analisa Bahan, Departemen Fisika IPB; analisis proksimat dan asam amino di Laboratorium Saraswanti Indo Genetech; analisis gugus fungsi
dengan Fourier Transform Infrared Spectroscopy FTIR dan analisis pH di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB; analisis berat molekul dengan metode
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia PAU-IPB; analisis termal, derajat putih,
viskositas, dan solubilitas di Laboratorium Pengolahan Pangan, Departemen Ilmu Teknologi Pangan IPB; dan analisis struktur permukaan dengan Scanning
Electron Microscopy SEM di Laboratorium Geologi Kuarterner, Pusat Penelitian dan Pengembangan Geologi Kelautan, Bandung.
3.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan untuk ekstraksi kolagen dan pembuatan nanopartikel kolagen diantaranya stirring hot plate merek Favorit, magnetic stirrer
ukuran 5 cm, spektrofotometer UV-VIS merek Hitachi U-2800, freeze dryer merek Labconco, rotary evaporator merek Heidolph WB2000, dan Particle Size
Analyzer merek Vasco. Sementara alat-alat yang digunakan untuk analisis diantaranya Atomic Absorption Spectrophotometer AAS, High Performance
Liquid Chromatography HPLC merek waters coorporation USA, Viscometer
Brookfield LV, Bruker Tensor 37 Fourier Transform Infrared Spectrophotometer
,
Scanning Electron Microscopy SEM merek JEOL JSM-6360-LA,
Differential Scanning Calorimetry
DSC-60 merek Shimadzu, dan Whiteness meter C-100. Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit ikan pari
Pastinachus solocirostris. Ikan pari Pastinachus solocirostris diperoleh dari
pasar Flamboyan Pontianak. Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi kolagen dan pembuatan nanopartikel kolagen terdiri dari NaOH serbuk, asam
asetat CH
3
COOH, akuades, dan etanol. Bahan-bahan lain meliputi bahan untuk analisis karakteristik kolagen dan nanopartikel kolagen.
3.3 Metode
Penelitian ini dilakukan dalam empat tahap, yaitu 1 karakterisasi bahan baku kulit ikan pari; 2 optimasi ekstraksi kolagen; 3 pembuatan nanopartikel
kolagen; 4 karakterisasi kolagen dan nanopartikel kolagen. Tahap pertama dilakukan dengan tujuan untuk menilai kelayakan kulit ikan sebagai bahan baku
kolagen. Tahap kedua bertujuan mendapatkan metode ekstraksi kolagen terbaik. Tahap ketiga bertujuan untuk mendapatkan metode pembuatan nanopartikel
kolagen. Tahap keempat bertujuan untuk mendapatkan karakteristik fisik dan kimia kolagen dan nanopartikel kolagen yang dihasilkan dari metode terbaik pada
tahap sebelumnya.
3.3.1 Karakterisasi bahan baku
Kulit ikan pari yang akan digunakan dikarakterisasi terlebih dahulu dengan
malakukan analisis komposisi kimia kulit yang meliputi kadar air, abu, protein,
lemak, dan logam berat Hg, Pb, dan As.
3.3.2 Optimasi ekstraksi kolagen
Ekstraksi kolagen dilakukan dengan tiga tahap, yaitu deproteinasi menggunakan larutan NaOH, perendaman dalam larutan asam asetat
CH
3
COOH, dan ekstraksi dengan air. Proses deproteinasi dengan larutan NaOH dan proses perendaman dalam asam asetat dilakukan pada suhu kamar. Tahap
pertama adalah proses deproteinasi yaitu perendaman kulit dalam larutan NaOH dengan tujuan untuk menghilangkan protein non kolagen. Rasio antara kulit
dengan larutan NaOH adalah 1:10 wv. Pada tahap ini digunakan tiga variasi konsentrasi NaOH yaitu 0,05; 0,1; dan 0,2 M dengan lama waktu perendaman
selama 8 jam. Setiap 2 jam sekali dilakukan penggantian pelarut dan larutan NaOH sisa perendaman kulit yang dihasilkan diuji kandungan protein secara
kuantitatif dengan uji biuret untuk menentukan konsentrasi NaOH dan lama waktu perendaman terbaik.
Kulit hasil proses deproteinasi dengan konsentrasi NaOH dan lama waktu perendaman terbaik dicuci dengan air mengalir sampai mencapai pH netral
sebelum dilanjutkan pada tahap kedua yaitu perendaman dalam larutan asam asetat CH
3
COOH. Pada tahap ini digunakan variasi dua faktor perlakuan yaitu konsentrasi asam asetat dan lama waktu perendaman. Konsentrasi asam asetat
yang digunakan terdiri dari 0,05; 0,1; dan 0,2 M; sedangkan waktu perendaman adalah 1 dan 2 jam. Rasio antara kulit dengan larutan asam asetat adalah
1:6 wv. Parameter uji yang digunakan pada tahap ini adalah pengukuran derajat pengembangan DP dari kulit dan uji kelarutan kolagen dalam larutan
asam asetat dengan menggunakan NaCl 5 M. Kulit hasil perendaman asam asetat dengan perlakuan terbaik dicuci
dengan air mengalir sampai mencapai pH netral sebelum dilanjutkan pada tahap ketiga yaitu ekstraksi dengan air pada suhu 40
C selama 2 jam dengan rasio antara kulit dan air adalah 1:2 wv. Hasil ekstrak berupa kolagen larut air,
selanjutnya dikeringkan dengan freeze dryer untuk memperoleh kolagen dalam bentuk serbuk. Alur proses ekstraksi kolagen dari kulit ikan pari dapat dilihat
pada Gambar 6.
3.3.3 Pembuatan nanopartikel kolagen
Proses pembuatan nanopartikel kolagen diawali dengan pembuatan kolagen larut air dengan prosedur berdasarkan perlakuan terbaik yang diperoleh pada
tahap optimasi ekstraksi kolagen, selanjutnya kolagen larut air diproses lebih lanjut untuk membentuk partikel berukuran kecil yaitu dalam bentuk nanopartikel.
Pengecilan ukuran dilakukan dengan proses pengadukan pada kecepatan tinggi menggunakan stirer pada suhu 40
C selama 1 jam. Nanopartikel kolagen yang terbentuk selama proses pengadukan terdispersi dalam larutan dan distabilkan
dengan penambahan etanol dingin. Pada tahap ini, digunakan variasi rasio larutan kolagen terhadap etanol, yaitu 1:1, 1:2, dan 1:3. Analisis ukuran partikel kolagen
yang dihasilkan pada setiap perlakuan dilakukan menggunakan alat Particle Size Analyzer PSA. Prosedur pembuatan nanopartikel kolagen dapat dilihat pada
Gambar 7.
Gambar 6 Alur proses ekstraksi kolagen modifikasi dari Kittiphattanabawon et al. 2010a.
Analisis proksimat logam berat
Pencucian Perendaman dalam Larutan NaOH
rasio kulit terhadap larutan NaOH =1:10 wv konsentrasi NaOH = 0,05 M; 0,1 M; 0,2 M
waktu = 8 jam Uji kandungan protein larutan NaOH
sisa perendaman setiap 2 jam
Pencucian air mengalir, pH netral
Prendaman dalam Larutan CH
3
COOH rasio kulit terhadap larutan CH
3
COOH = 1:6 wv konsentrasi CH
3
COOH = 0,05 M; 0,1 M; 0,2 M waktu = 1 dan 2 jam
Derajat pengembangan DP kulit dan kelarutan kolagen
Ekstraksi dengan air 40
C, 2 jam dengan rasio kulit terhadap air = 1:2 wv
Freeze dryer Pencucian
air mengalir, pH netral
Kulit ikan pari
Kulit hasil perendaman asam asetat perlakuan terbaik
Kolagen larut air
Serbuk kolagen larut air
Kulit perendaman NaOH perlakuan terbaik
Kandungan protein terendah
DP kulit tertinggi dan kelarutan kolagen terendah
Kategori