b. Pompa. Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mLmenit. Untuk tujuan preparatif, pompa
yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mLmenit Rohman, 2009.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada dua jenis pompa dalam KCKT, yaitu pompa dengan tekanan konstan dan pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan
Rohman, 2009. c.
Tempat Penyuntikan Sampel. Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju
kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel sample loop internal
atau eksternal Rohman, 2009. d.
Kolom. Ada dua jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian KCKT yang mana terdapat fase
diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solutanalit Rohman, 2009.
Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom konvensional, yaitu:
Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80 atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat 10-100 µLmenit
Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrofotometer
massa Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih
pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis Rohman, 2009.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin
Rohman, 2009. Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi,
atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol Si-OH Rohman,
2009. Silika dapat dimodifikasi secara kimia dengan menggunakan reagen-
reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain
Rohman, 2009.
Oktadesil silika ODS atau C
18
merupakan fase diam yang paling banyak diguunkan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil nitril lebih cocok sebagai pengganti silika yang dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi
yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan Rohman, 2009.
e. Detektor. Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu
detektor universal yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor
spektrofotometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluorosensi, dan elektrokimia Rohman, 2009.
Gambar 3 . Diagram sistem KCKT. a Wadah fase gerak; b pompa; c autosampler
atau injektor; d kolom; e detektor; f sistem data Synder, Kirkland and Dolan, 2010
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: 1 mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
2 mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil; 3 stabil dalam pengoperasiannya; 4 mempunyai
sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita; 5 signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas kisaran dinamis linier; dan 6 tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak Rohman, 2009.
2. Pemisahan Puncak dalam Kromatografi
Tujuan utama pada kromatografi adalah pemisahan suatu campuran. Ada dua parameter yang digunakan untuk menilai kualitas pemisahan pada
kromatografi, yaitu banyaknya pelebaran puncak efisiensi dan tingkat pemisahan puncak yang berdekatan Gandjar dan Rohman, 2010. Kualitas
pemisahan dengan kromatografi kolom dapat dikontrol dengan melakukan serangkaian uji kesesuaian sistem yang meliputi efisiensi kolom, resolusi atau
daya pisah, simetrisitas puncak, dan faktor retensi atau kapasitas kolom Rohman, 2009.
Ada tiga faktor mendasar dalam KCKT, yaitu: retensi, selektifitas, dan efisiensi. Ketiga faktor ini mengendalikan pemisahan resolusi dari analit.
Kemudian akan dibahas persamaan van Deemter dan menunjukkan bagaimana diameter partikel bahan pengepakan dan laju alir mempengaruhi efisiensi kolom
Ahuja and Dong, 2005.
Gambar 4 menunjukkan kromatogram yang khas, yang mencakup sumbu waktu, titik injeksi, dan puncak analit. Waktu antara titik injeksi sampel dan analit
mencapai detektor disebut waktu retensi t
R
. Waktu retensi komponen yang tidak tertahan sering ditandai oleh baseline pertama yang disebabkan oleh elusi sampel
pelarut disebut waktu void t . Waktu kosong berhubungan dengan volume
kosong kolom V , yang merupakan parameter penting yang akan diuraikan
kemudian. Puncak juga memiliki lebar W
b
dan tinggi h. Ketinggian atau daerah di bawah puncak sebanding dengan konsentrasi atau jumlah komponen
tertentu dalam sampel. Waktu retensi digunakan untuk identifikasi puncak yang tergantung pada laju aliran, dimensi kolom, dan parameter lainnya. Ahuja and
Dong, 2005. Sebuah istilah yang lebih mendasar yang mengukur tingkat retensi analit
adalah faktor ka pasitas atau faktor retensi k’, dihitung dengan waktu retensi
bersih t’
R
, waktu retensi dikurang waktu kosong. Faktor kapasitas mengukur berapa kali analit tertahan relatif terhadap komponen yang tidak tertahan Ahuja
and Dong, 2005.
Gambar 4 . Kromatogram yang menunjukkan waktu retensi t
R
, waktu kosong t , lebar
dasar puncak W
b
, dan tinggi puncak h Ahuja and Dong, 2005
N ilai k’ nol berarti bahwa komponen tersebut tidak tertahan dan terelusi
dengan pelarut. Nilai k’ 1 berarti bahwa komponen sedikit ditahan oleh kolom
sementara k ’ nilai 20 berarti bahwa komponen sangat dipertahankan dan
menghabiskan banyak waktu berinteraksi dengan fase diam. Dalam kebanyakan tes, analit terelusi dengan k’ antara 1 dan 20 sehingga memiliki kesempatan yang
cukup untuk berinteraksi dengan fase diam yang mengakibatkan migrasi yang berbeda. Puncak yang terelusi pada
di k’ yang besar 20 bermasalah karena jangka waktu panjang dan sensitifitas kecil yang dapat mengakibatkan puncak
yang lebar Ahuja and Dong, 2005. Pada KCKT fase terbalik digunakan fase diam hidrofobik seperti C-18
dan fase gerak yang hidrofilik seperti campuran metanol dan air, partisi yang terjadi dianalogikan seperti ekstraksi cair-cair dua fase dalam corong pisah antara
larutan non-polar misalnya heksan dan larutan polar misalnya air. Pada KCKT fase terbalik, waktu retensi dipengaruhi oleh kekuatan atau polaritas fase gerak
Ahuja and Dong, 2005. Selektifitas
∝ atau faktor pemisahan adalah ukuran retensi diferensial dua analit. Selektifitas didefinisikan sebagai
rasio dari faktor kapasitas k’ dari dua puncak seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5. Selektivitas harus 1,0
untuk pemisahan puncak. Selektivitas tergantung pada sifat dari fase diam dan komposisi fase gerak Ahuja and Dong, 2005. Menurut Snyder, Kirkland, and
Glajch 2012 nilai k’ harus memenuhi 0,5 k’ 20. Perhitungan selektifitas.
∝=
�
−
�
−
Jika nilai k’ menjadi lebih kecil terelusi lebih awal maka resolusi menjadi lebih buruk. Ketika k’ dibuat lebih besar, resolusi meningkat. Jika ∝
meningkat, Rs akan meningkat juga. Nilai N dipengaruhi oleh kecepatan alir, panjang kolom, dan ukuran partikel Snyder, Kirkland, and Glajch, 2012.
Perhitungan k’ dengan rumus. �′ =
�
−
Gambar 5 . Pengaruh k’, ∝, dan N pada pemisahan Snyder, Kirkland, and Glajch, 2012
Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling penting adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis atau N Rohman, 2009. Sebagian
kromatogram memiliki puncak yang cenderung berbentuk Gaussian dan melebar, di mana W
b
menjadi lebih besar dengan bertambahnya t
R
. Hal ini disebabkan oleh efek pelebaran pita dalam kolom, dan merupakan dasar untuk semua proses
kromatografi. Jumlah lempeng N adalah ukuran kuantitatif dari efisiensi kolom Ahuja and Dong, 2005. Persamaan untuk menghitung N.
� = ,
�
�
�
Konsep lempeng secara tradisional berasal dari proses penyulingan di industri menggunakan kolom yang distilasi terdiri dari beberapa lempeng di mana
cairan kondensasi berada dalam kesetimbangan dengan uap yang naik. Dengan demikian, semakin panjang kolom distilasi akan memiliki lebih banyak lempeng
atau terjadinya equilibrium. Demikian pula dalam kromatografi, tinggi setara lempeng teoritis atau HETP height equivalent theoretical plate sama dengan
panjang kolom L dibagi dengan jumlah lempeng teoritis N Ahuja and Dong, 2005. HETP merupakan panjang kolom kromatografi dalam mm yang
diperlukan sampai terjadinya satu kali kesetimbangan molekul analit dalam fase gerak dan fase diam Gandjar dan Rohman, 2010. HETP dihitung dengan rumus.
���� = �
� Nilai N yang tinggi disarankan untuk pemisahan yang baik yang nilainya
sebanding dengan semakin panjangnya kolom L dan semakin kecilnya nilai H. Istilah H merupakan tinggi setara lempeng teoritis atau HETP height equivalent
theoretical plate Rohman, 2009. Kolom yang baik akan mempunyai bilangan
lempeng yang tinggi dan nilai HETP yang rendah. Ukuran partikel berpengaruh terhadap nilai H. Semakin kecil ukuran partikel maka semakin tinggi bilangan
lempeng teoritis Rohman, 2009.
