35 disesuaikan dengan tujuan pemisahan komponen dan sifat-sifat sampel yang akan
dianalisis. Pelarut yang digunakan umumnya berupa air dan larutan-larutan buffer serta pelarut-pelarut dengan kekentalan rendah, seperti aseton 0,32, asetonitril 0,37,
ethyl asetat 0,47, tetrahidrofuran 0,51, kloroform 0,57, metanol 0,60 dan air dengan kekentalan 1,00 Pomeranz dan Meloan, 1994. Pada umumnya para peneliti
menggunakan pelarut-pelarut, seperti : air; asam asetat-metanol; asam asetat; asam asetat – air; air-asetonitril;metanol: tetrahidrofuran; dan metanol – air, baik dengan
sistem isokratik ataupun sistem gradien. Terhadap hasil fraksi-fraksi tersebut kemudian dilakukan pengujian aktivitas
antibakteri untuk melihat aktivitas antibateri yang paling kuat.
3. Metode Isolasi dan Identifikasi secara Elektroforesis
Prinsip elektroforesis adalah pemisahan senyawa protein menjadi molekul- molekul dengan isoelektrik yang ditimbulkan oleh adanya perbedaan muatan antara
dua kutub positif dan negatif, sehingga molekul yang bermuatan negatif akan bergerak ke arah muatan positif atau sebaliknya.
Identifikasi untuk menentukan golongan suatu senyawa protein dapat dilakukan dengan uji golongan dan dapat menggunakan beberapa metode. Salah satu
metode yang digunakan adalah elektroforesis gel dengan kondisi denaturasi SDS- PAGE dan kondisi non denaturasi.
Banyak molekul biologis bermuatan listrik yang besarnya tergantung jenis molekul, pH dan komposisi medium pelarutnya. Dalam medium tertentu, molekul-
molekul tersebut akan bergerak kearah elektroda yang polaritasnya berlawanan apabila diberikan arus listrik. Prinsip inilah yang digunakan dalam elektroforesis Nur,
1989. Kecepatan bergerak molekul bermuatan dalam medium yang dialiri arus listrik akan tergatung pada densitas muatan charge density yaitu rasio antara jumlah
36 muatan dengan berat molekulnya. Semakin besar nilai densitas muatan, semakin
cepat molekul tersebut bergerak Hames dan Rickwood, 1981. Elektroforesis gel poliakrilamid termasuk jenis elektroforesis zona. Pada
metode elektroforesis digunakan medium penyangga seperti kertas, selulosa asetat, pati atau poliakrilamid untuk mencegah gangguan atau kelemahan yang terdapat pada
jenis elektroforesis moving boundery. Dengan adanya medium penyangga, gangguan karena konveksi dapat dihilangkan Hames dan Rickwood, 1981; Nur, 1989.
Poliakrilamid merupakan bahan yang sangat banyak digunakan sebagai medium elektroforesis. Terdapat beberapa keuntungan bila menggunakan poliakrilamid
sebagai medium elektroforesis. Pertama adalah sifat gelnya yang transparan sehingga dapat diperiksa pada sinar tampak maupun ultraviolet. Kedua adalah secara kimiawi
poliakrilamid fleksibel dan stabil pada kisaran pH yang luas, suhu dan kekuatan ion. Ketiga adalah ukuran pori gel poliakrilamid dapat diatur sehingga pemisahan dapat
didasarkan atas ukuran dan muatan. Gel poliakrilamid terjadi karena adanya polimerisasi akrilamid dan sejumlah crooslinking reagent metil biakrilamid. N
1
N
1
N- tetramethylene-ethylenediamine TEMED akan mengkatalis pembentukan radikal
bebas dari amonium persulfat, radikal bebas ini memulai terjadinya polimerisasi akrilamid Laemli, 1970.
Gel elektroforesis dapat dilakukan pada kondisi protein tidak terdenaturasi elektroforesis natif. Proses preparasi dan operasi kedua metode gel elektroforesis
secara umum sama, kecuali pada elektroforesis natif: 1 buffer Tris untuk gel pemisah dan stacking gel serta buffer sampel tidak mengandung SDS sodium dodesil sulfat
dan 2-merkaptoetanol; 2 sampel protein yang dianalisis tidak dipanaskan sebelum dimasukkan kedalam gel dan 3 selama running digunakan voltase rendah, sehingga
pemanasan sampel dalam gel tetap minim Bollag dan Edeistein, 1991; Coppeland, 1994; Walker, 1994.
37 Hasil gel elektroforesis terdenaturasi dan terpisah SDS-PAGE selain
menunjukkan berat molekul subunit-subunit penyusun protein juga dapat memperlihatkan kemurnian suatu protein dan keragaman polipeptida-polipeptida
penyusun protein tersebut Bollag dan Edelstein, 1991. Sedangkan dari hasil gel elektroforesis natif dapat diketahui aktivitas biologis suatu protein misalnya aktivitas
enzim, ikatan reseptor dan ikatan antibodi Walker, 1994.
4. Metode Spektrofotometer
