53 mendapatkan fase pelarut dan fase air; 2 Evaporasi untuk membuang sisa hexane
yang mungkin masih terdapat di dalam larutan fase air; 3 Clean uppembersihan menggunakan cartridge seppak C-18; 4 Setelah disaring dan dibilas dengan air
dielusi dengan methanol; 5 Pengeringan dengan menggunakan evaporator untuk menghilangkan metanol dan residu yang diperoleh ditambah aquades 2 ml, kemudian
disaring dengan s aringan 0,5 ì m dan 0,22 ì m; 6 Injek ke KCKT sebanyak 10 ì l untuk mendapatkan fraksi-fraksi; dan 7 Fraksinasi komponen antimikroba susu kuda
Sumbawa; seperti digambarkan pada Gambar 5. Seluruh fraksi yang keluar dari KCKT ditampung kemudian diuji terhadap
aktivitas antimikrobanya. Fraksi yang mempunyai aktivitas antimikroba paling kuat dilanjutkan dengan isolasi dan identifikasi senyawa antimikroba.
8. Percobaan Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antimikroba
Isolasi dilakukan terhadap fraksi yang paling kuat aktifitas antimikrobanya. Fraksi dengan aktivitas antimikroba terkuat selanjutnya diidentifikasi, untuk mengetahui
adanya komponen senyawa antimikroba. Identifikasi diawali dengan uji kualitatif dengan metode Bradford Bradford, 1976. Bahan yang berupa sampel susu sebanyak
100 ì l dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2 ml pereaks i protein, campuran dihomogenesasi satu menit dan didiamkan lima sampai sepuluh
menit, selanjutnya diamati adanya warna biru. Apabila hasilnya positif terus dilanjutkan dengan uji elektroforesis untuk mengetahui berat molekulnya. Berat molekul dapat
diketahui dengan cara membandingkan sampel fraksi yang paling kuat aktivitas antimikrobanya dengan phosphorylase b, albumin, ovalbumin, carbonic anhydrase,
trypsin inhibition dan lactalbumin yang telah diketahui berat molekulnya serta laktoferin sebagai pembanding.
54
Gambar 5. Fraksinasi komponen antimikroba susu kuda Sumbawa
P ER S IA P A N FR A K S IN A S I K O N D IS I K C K T : C O LU M N C A P C E LL P A C K C – 18
U K U R A N : D IA M E TE R 4,6 m m x 150 m m K O N D IS I FA S E G E R A K : M eO H : D W =5 : 95 1m lm in
FLO W R A TE : 1 m l m in D E TE C TO R : D IO D E A R R A Y ,W A V E LE N G TH = U V 200 nm
IN JE C TIO N : 10 ul
Elusi Seppak C- 18 Evaporasi membuang sisa methanol
TAMBAH AQUADES 2 – 5 ml FILTRASI 0,5 • m dan 0,22 • m
KCKT
FR A K S I-FR A K S I
UJI ANTIMIKROBA SUSU KUDA SUMBAWA
Fase air Skim
TE R K U A T
FRAKSI 7 Evaporasi membuang sisa Hexan
Pembersihan dengan cartridge seppak C- 18
Sampel yang diuji dengan elektroforesis adalah sampel denaturasi, yaitu sampel yang telah didenaturasi sebelumnya dengan cara dipanaskan terlebih dahulu
dalam penangas air s elama 2 menit. S etelah itu s ampel s ebanyak 8 ì l dicampur
55 dengan buffer sebanyak 5 kali sampel kemudian dimasukkan ke dalam sumur
separating gel, selanjutnya steker elektroda dipasang pada power supply yang distabilkan dengan stabilizer yang dihubungkan pada listrik tegangan 125 Volt, selama
lebih kurang 1,5 jam atau sampai migrasi sampel mencapai 1 cm dari bawah gel. Setelah itu gel diambil dari kedua plat elektroforesis dengan menggunakan spatula,
kemudian dilanjutkan pewarnaan dengan menggunakan Coomassie Brilliant Blue; dengan cara sebagai berikut: gel ditempatkan dalam wadah yang telah diisi larutan
staining Coomassie Brilliant Blue lebih kurang 20 ml, kemudian diagitasi konstan dengan gerakan pelan lebih kurang 30 menit. Setelah 30 menit larutan Coomassie
Brilliant Blue dihilangkan atau destaining dengan menggunakan campuran methanol; asam asetat glasial; aquades = 2 : 1 : 7 kurang lebih 20 ml. Gel yang telah dihilangkan
warnanya diagitasi konstan sampai pita-pita protein yang terbentuk terlihat nyata dan warna latar gel menjadi terang setelah lebih kurang 24 jam.
9. Percobaan Karakterisasi Gugus Fungsi dengan Spektrofotometer Infra Merah dan Spektrofotometer UV
