Metode Pengujian Bakteri E.coli pada Makanan

34 Langkah-langkah untuk melakukan pemeriksaan bakteri E.coli pada makanan dengan menggunakan metode MPN menurut APHA 2001 adalah sebagai berikut Da Silva et. al, 2012: 1 Persiapan sampel dan inokulasi Sebanyak 25 gram sampel makanan atau 25 ml sampel minuman dilarutkan dalam 225 ml air peptone 0,1 atau buffer Butterfield’s Phospate pengenceran 10 -1 . Setelah itu dilakukan pengenceran dan memasukkan larutan tersebut ke dalam tabung reaksi dengan konsentrasi larutan untuk masing-masing tabung sebesar 10 -1 , 10 -2 , dan 10 -3 . Kemudian dilakukan inokulasi sampel dalam masing-masing tabung reaksi tersebut ke tabung reaksi lain yang telah berisi media berupa larutan Lauryl Sulfate Tryptose LST sebanyak 1 ml. 2 Inkubasi untuk uji presumtif Tabung reaksi yang berisi larutan LST hasil inokulasi sampel kemudian diinkubasi pada suhu 35,5 o C selama 24 – 26 jam dan perhatikan apakah terdapat gas yang terbentuk, apabila terdapat tabung rekasi yang tidak terbentuk gas, maka dilakukan inkubasi kembali selama 24 jam. 3 Uji penegasan Dari masing-masing tabung reaksi yang terbentuk gas, ambil 1 ose sampel dari dalam tabung tersebut dan inokulasi pada larutan BGB. Kemudian tabung reaksi yang berisi larutan BGB diinkubasi pada suhu 35,5 o C selama 24 – 26 jam dan periksa apakah terbentuk gas. Jika terbentuk gas maka mengindikasikan hasil yang positif. 35 4 Uji pelengkap Pada tabung reaksi yang berisi larutan BGB dan terbentuk gas, kemudian diambil 1 ose sampel dan ditanam pada cawan petri yang berisi agar Levine’s Eosin Methylene Blue L-EMB. Inkubasi cawan petri tersebut pada suhu 36 o C selama 24 – 26 jam. Setelah itu akan tumbuh koloni bakteri yang kemudian ditanam kembali pada tabung reaksi yang berisi Plate Count Agar PCA dan inkubasi pada suhu 36 o C selama 24 – 26 jam. Setelah diinkubasi, maka dilakukan serangkaian uji biokimia sebagai berikut: a. Masukkan 1 ose sampel dari tabung reaksi yang berisi PCA ke dalam tabung reaksi yang berisi Koser’s Citrate Broth atau Simmons Citrate Agar. Lalu inkubasi pada suhu 36 o C selama 96 – 98 jam. b. Masukkan 1 ose sampel dari tabung reaksi yang berisi PCA ke dalam tabung reaksi yang berisi MR-VP Broth. Lalu inkubasi pada suhu 36 o C selama 48 – 50 jam VP atau pada suhu 36 o C selama 96 – 98 jam MR. c. Masukkan 1 ose sampel dari tabung reaksi yang berisi PCA ke dalam tabung reaksi yang berisi Tryptone Tryptophane Broth. Lalu inkubasi pada suhu 36 o C selama 24 – 26 jam. d. Ambil 1 ose sampel dari tabung reaksi yang berisi PCA dan letakkan pada kaca preparat untuk dilakukan pewarnaan gram. Jika hasil uji citrate, VP dan pewarnaan gram menunjukkan hasil negatif, serta uji MR dan indol menunjukkan hasil positif, maka dapat dikonfirmasi bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri E.coli. 36 c Presence – Absence PA Testing Metode Presence-Absence PA merupakan modifikasi sederhana dari metode MPN. Penyederhanaan dilakukan dengan menggunakan satu porsi besar dalam botol kultur tunggal untuk mendapatkan informasi kualitatif, yaitu ada tidaknya mikroba. Metode ini dikembangkan dengan penambahan substrat fluorogenic dapat digunakan untuk menumbuhkan dan membedakan bakteri E.coli dari bakteri lainnya Indriani, 2010. Pengujian bakteri E.coli pada makanan dilakukan dengan menggunakan media yang mengandung substrat berupa fluorogenic dan chromogenic, dimana bertujuan untuk mengetahui jenis mikroorganisme dengan mengidentifikasi aktivitas enzim spesifik yang dimiliki oleh mikroorganisme tersebut Merck, 2004. Kelebihan dari metode PA ini antara lain dapat mendeteksi keberadaan bakteri E.coli secara simultan, prosedurnya lebih mudah dan cepat daripada pengujian TLP maupun MPN, lebih murah karena tidak memerlukan bahanmaterial yang banyak dan proses inkubasi dapat dilakukan dilapangan Merck, 2004. Namun, kelemahan dari metode ini adalah apabila hasilnya positif maka tidak ada informasi secara kuantitatif tentang tingkat kontaminasi yang terjadi dan sensitivitas dari metode ini sangat tergantung pada jumlah sampel yang dianalisa Indriani, 2010. Langkah-langkah untuk melakukan uji bakteri E.coli pada makanan dengan media Fluorocult LMX Broth adalah sebagai berikut Merck, 2004: 1. Pembuatan larutan Fluorocult LMX dan inokulasi bakteri Larutan Fluorocult LMX dibuat dengan melarutkan 17 gram Fluorocult LMX dengan 1 liter aquades. Kemudian dicampurkan dengan menggunakan hotplate dan masukkan sebanyak 20 ml ke dalam tabung 37 reaksi. Sebanyak 25 gram sampel makanan yang akan diperiksa dilarutkan dengan aquades kemudian masukkan sebanyak 5 ml ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan Fluorocult LMX, sedangkan untuk sampel minuman masukkan sebanyak 10 ml. 2. Inkubasi dan uji penegasan Sampel yang telah diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi larutan Fluorocult LMX kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 36 o C. Untuk mengetahui ada tidaknya bakteri E.coli pada sampel yang diuji tersebut, teteskan reagen kovacs sebanyak 5 – 10 tetes. 3. Interpretasi hasil Setelah diteteskan reagen kovacs maka tabung reaksi yang terbentuk cincin berwarna merah menandakan bahwa sampel dalam tabung reaksi tersebut positif mengandung bakteri E.coli. Sedangkan apabila tidak terbentuk cincin berwarna merah, maka negatif mengandung E.coli.

2.6 Penyakit Bawaan Makanan Foodborne Disease

Penyakit bawaan makanan adalah suatu penyakit yang biasanya bersifat toksik maupun infeksius, disebabkan oleh agen-agen penyakit yang masuk ke dalam tubuh melalui konsumsi makanan yang terkontaminasi WHO, 2006. Sedangkan menurut Arisman 2009 penyakit bawaan makanan adalah penyakit yang ditularkan melalui makanan, tanpa memperdulikan apakah mikroorganisme, baik bakteri, virus maupun parasit tersebut menghasilkan racun atau tidak. Jenis penyakit bawaan makanan terbagi menjadi tiga kategori, yaitu penyakit yang disebabkan oleh mikroorganisme termasuk parasit yang menginvasi dan bermultiplikasi dalam tubuh; penyakit yang disebabkan oleh toksin yang dihasilkan mikroorganisme yang berkembang biak dalam saluran pencernaan; dan penyakit 38 yang disebabkan oleh konsumsi makanan yang terkontaminasi dengan bahan kimiawi yang beracun atau mengandung toksin alami yang dihasilkan oleh miikroorganisme dalam makanan yang dikonsumsi Sockett, 2001. Makanan dapat terkontaminasi oleh berbagai racun yang dapat berasal dari tanah, udara, manusia dan vektor. Apabila racun tersebut tidak dapat diuraikan, akan terjadi bioakumulasi dalam tubuh makhluk hidup melalui rantai makanan Sumantri, 2013. Menurut Missouri SPHL 2015, foodborne disease yang disebabkan oleh mikroorganisme dapat diklasifikasikan sebagai berikut: Tabel 2.3 Klasifikasi Foodborne Disease Berdasarkan Jenis Mikroorganisme Onset Gejala Utama Mikroorganisme Penyebab 6 – 24 Jam Kram perut, diare, mual dan muntah Bacillus cereus Clostridium perferingens 10 – 72 Jam Kram perut, diare, mual dan muntah muntah lebih sering terjadi pada anak, sedangkan diare lebih sering terjadi pada orang dewasa Noroviruses 12 – 72 Jam Kram perut, diare dapat berdarah atau berlendir, demam, menggigil, tidak enak badan dan sakit kepala Salmonella sp Shigella sp E.coli pathogen Vibrio sp Yersinia sp Campylobacter sp Aeromonas atau Plesiomonas sp 3 Hari – 6 Minggu Diare kronis, lemas, sakit perut, kelelahan, dan penurunan berat badan Giardia lamblia 1 – 6 Jam Mual, muntah, kram perut, diare Bacillus cereus Staphylococcus aureus 24 – 72 Jam Mual, muntah, demam, sakit perut, diare berair Rotaviruses 2 – 30 Hari Mual, sakit perut dank ram, muntah pada anak, diare berair pada orang dewasa, demam Cryptosporidium parvum 3 Hari – Beberapa Bulan Sakit perut, diare berdarah, sakit kepala, konstipasi namun Entamoeba histolytica 39 Onset Gejala Utama Mikroorganisme Penyebab diselingi diare, mudah mengantuk 1 – 11 Hari Diare berkepanjangan hingga 7 minggu, kelelahan, kram, penurunan berat badan, dan anorexia Cylospora cayetanensis 3 – 30 Hari Diare lebih dari 1 minggu, gejala gangguan saluran pernafasan Adenoviruses tipe 40 dan 41 Terjadinya penyakit bawaan makanan jika terdapat 3 hal berikut Hartono, 2006: b. Jumlah bakteri dalam makanan harus cukup banyak dan dapat bertahan hidup setelah dimasak atau disimpan. c. Bakteri dalam makanan harus berkembang biak dan mencapai jumlah yang cukup atau menghasilkan toksin dalam jumlah yang cukup untuk menimbulkan penyakit. d. Bakteri harus masuk ke tempat pengolahan makanan atau terdapat dalam bahan mentah maupun peralatan dan permukaan tempat pengolahan makanan, serta tangan tangan yang tidak dicuci.

2.7 Pencegahan Penyakit Bawaan Makanan Foodborne Disease

Makanan yang terkontaminasi oleh bakteri Escherichia coli dapat menimbulkan berbagai penyakit bagi orang yang mengkonsumsinya. Untuk itulah diperlukan upaya-upaya pencegahan kontaminasi terhadap makanan. Menurut WHO 2006, terdapat 5 cara menjaga keamanan makanan dari aspek penjamah makanan, antara lain:

a. Menjaga Kebersihan Keep Clean

Berbagai jenis bakteri patogen dapat ditemukan pada tanah, air, hewan dan manusia. Bakteri tersebut terbawa oleh tangan dan terdapat pada kain lap 40 maupun peralatan pengolahan makanan, seperti talenan yang dapat menyebabkan perpindahan bakteri ke makanan sehingga terjadi penyakit bawaan makanan. Untuk itulah diperlukan praktik kebersihan dalam melakukan pengolahan makanan, antara lain: 1 Mencuci tangan sebelum dan selama persiapan pengolahan makanan. 2 Mencuci tangan setelah dari toilet. 3 Mencuci dan mensterilkan area permukaan tempat pengolahan makanan dan peralatan pengolahan makanan. 4 Menjaga area tempat pengolahan makanan dari serangga, hewan peliharaan maupun binatang lainnya.

b. Memisahkan Bahan Mentah dengan Makanan Matang Seperate Raw and

Cooked Bahan makanan mentah seperti daging, telur, dan ikan dapat mengandung mikroorganisme berbahaya yang dapat berpindah ke makanan lainnya selama proses pengolahan dan penyimpanan makanan. Untuk itu perlu diperhatikan hal-hal berikut: 1 Memisahkan daging, telur dan ikan mentah dari makanan lain. 2 Menggunakan peralatan yang berbeda dalam melakukan pengolahan makanan, seperti pisau dan talenan yang berbeda. 3 Melakukan penyimpanan pada kontainer yang berbeda untuk menghindari kontak antara bahan mentah dengan makanan matang.

c. Memasak dengan Sempurna Cook Thoroughly

Memasak dengan cara yang benar dapat membunuh hampir semua jenis bakteri yang berbahaya. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa memasak