Tahap pendahuluan Tahapan Penelitian

ANOVA untuk melihat perbedaan pada sampel. Jika berpengaruh nyata dapat dilanjutkan dengan uji Duncan Lampiran 2 3. 3.4.2 Analisis Mikrobiologi a Pengujian kuantitatif total koloni mikroba Total Plate Count Bacteriological Analytical Manual BAM 2009 Media total koloni mikroba TPC yang digunakan adalah Plate Count Agar PCA Lampiran 4. Sampel diambil sebanyak 50 g, dilarutkan dengan 450 mL Butterfield’s phosphate-buffered water KH 2 PO 4 steril. Hasil tersebut sebagai sampel dengan larutan pengenceran 10 -1 . Selanjutnya dipipet secara aseptik sampel larutan pengenceran 10 -1 sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam larutan Butterfield’s phosphate-buffered water 9 mL steril. Hasil tersebut sebagai sampel dengan larutan pengenceran 10 -2 . Metode yang sama dilakukan sampai pada sampel larutan pengenceran 10 -5 . Selanjutnya dari setiap sampel larutan pengenceran, diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam cawan steril secara duplo, kemudian ditambahkan media PCA steril sebanyak 15-20 mL dengan suhu ±45 o C. Selanjutnya cawan tersebut diratakan dengan melakukan gerakan membentuk angka delapan dan didiamkan sampai media pada cawan tersebut menjadi padat. Apabila media pada cawan telah padat, cawan dibalikkan dan diinkubasi pada suhu 37 o kolonimL = rata – rata jumlah koloni x faktor pengenceran C selama 24-48 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni bakteri. Jumlah koloni bakteri dapat dihitung sebagai berikut: atau g b Pengujian kuantitatif total bakteri asam laktat Bacteriological Analytical Manual BAM 2009 Media tumbuh untuk bakteri asam laktat yang digunakan adalah de Man Rogosa Sharpe MRS Agar Lampiran 5. Sampel sebanyak 50 g dilarutkan dengan 450 mL Butterfield’s phosphate-buffered water KH 2 PO 4 steril untuk mendapatkan sampel dengan larutan pengenceran 10 -1 . Hasil sampel larutan pengenceran 10 -1 , dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukkan kedalam 9 mL larutan Butterfield’s phosphate-buffered water KH 2 PO 4 steril. Hasil tersebut sebagai sampel larutan dengan pengenceran 10 -2 . Demikian seterusnya dilakukan sampai pada sampel larutan pengenceran 10 -9 . Selanjutnya sampel larutan dari pengenceran yang dikehendaki 10 -6 - 10 -9 diambil sebanyak 1 mL dan diletakkan ke dalam cawan steril dan dituangkan media MRS Agar steril sebanyak 15-20 mL dengan suhu ± 45 o C. Selanjutnya cawan tersebut diratakan dengan melakukan gerakan membentuk angkak delapan. Cawan didiamkan sampai media dalam cawan tersebut menjadi padat. Apabila media pada cawan tersebut sudah padat, cawan dibalikkan dan diinkubasi pada suhu 37 o c Pengujian kualitatif bakteri Escherichia coli Bacteriological Analytical Manual BAM 2009 C selama 24-48 jam. Selanjutnya dihitung total koloni bakteri asam laktat, sama seperti penghitungan pada total koloni mikroba. Uji pendugaan coliform, fecal coliform dan Escherichia coli Sampel sebanyak 50 g dimasukkan ke dalam wadah steril. Selanjutnya ditambahkan 450 mL larutan Butterfield’s phosphate-buffered water steril ke dalam wadah yang berisi sampel, dihomogenkan dengan stomacher selama waktu 2 menit. Sampel larutan tersebut sebagai larutan pengenceran 10 -1 . Larutan pengenceran 10 -1 dipindahkan dengan pipet steril sebanyak 1 mL ke dalam 9 mL larutan Butterfield’s phosphate-buffered water steril untuk memperoleh larutan pengenceran 10 -2 . Metode yang sama dibuat untuk memperoleh larutan pengenceran 10 -3 . Selanjutnya dipipet 1 mL dari setiap larutan pengenceran yang digunakan 10 -1 -10 -3 Uji konfirmasi fecal coliform dan Escherichia coli dengan Most Probable Number MPN ke dalam 3 seri tabung Durham yang berisi 9 mL larutan Lauryl Sulfate Tryptose Broth LSTB steril Lampiran 6 dan diinkubasi pada suhu 35 °C selama 24±2 jam. Apabila setelah 24±2 jam belum terbentuk gas negatif, maka ditambahkan waktu inkubasi 24 jam menjadi 48±2 jam. Apabila tabung tersebut telah terbentuk gas, maka tabung tersebut dinyatakan positif. Sampel dalam tabung yang telah dinyatakan positif uji pendugaan dipindahkan dengan menggunakan jarum inokulasi ke dalam tabung yang telah berisi 9 mL Escherichia Coli Broth ECB steril Lampiran 7 dan diinkubasi pada suhu 45,5 °C selama 24 jam±2 jam. Apabila belum terbentuk gas negatif, maka dapat diinkubasi kembali selama 48 jam±2 jam. Hasil uji dinyatakan positif bila pada tabung tersebut terbentuk gas. Selanjutnya dengan menggunakan tabel MPN Lampiran 8 untuk menentukan nilai MPN berdasarkan jumlah tabung ECB yang positif sebagai jumlah E.colimL atau E.colig. Fecal coliform dan E.coli yang terdapat dalam sampel tabung diinterpretasikan dengan mencocokkan kombinasi jumlah tabung yang positif berdasarkan tabel MPN. Kombinasi yang diambil, dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif dan pada pengenceran berikutnya terdapat tabung yang negatif. Uji bakteri Escherichia coli Sampel larutan tabung ECB positif uji konfirmasi diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam cawan steril. Selanjutnya ditambahkan media Levine- Eosin Methylene Blue L-EMB Agar steril sebanyak 15-20 mL Lampiran 9, dan digerakkan membentuk angka delapan agar media dan sampel larutan tersebar merata pada cawan tersebut dan dibiarkan sampai padat. Setelah itu diiinkubasi pada suhu 35 °C selama 18-24 jam. Koloni bakteri E. coli berdiameter 2-3 mm, berwarna hitam atau gelap pada bagian pusat koloni, dengan atau tanpa metalik kehijauan yang mengkilat pada cawan tersebut. d Pengujian kualitatif bakteri Salmonella sp. Bacteriological Analytical Manual BAM 2009 Pra-pengayaan Sampel sebanyak 25 g secara aseptik dimasukkan ke dalam wadah steril dan ditambahkan sebanyak 225 mL larutan Lactose Broth LB steril Lampiran 10 dan dihomogenkan dengan stomacher selama waktu 2 menit. Hasil larutan berisi sampel tersebut, dipindahkan ke dalam erlenmeyer steril 500 mL dan diinkubasi pada suhu 35 °C selama 24 jam±2 jam. Pengayaan Sampel dari hasil pra-pengayaan tersebut dihomogenkan dan dipindahkan sampel tersebut masing – masing sebanyak 0,1 mL ke dalam media Rappaport- Vassiliadis RV sebanyak 10 mL Lampiran 11 dan 1 mL ke dalam media Tetrathionate TT Broth sebanyak 10 mL Lampiran 12. Selanjutnya sampel dalam masing-masing media tersebut dihomogenkan. Sampel dengan dugaan cemaran bakteri Salmonella sp. tinggi a high microbial load, pada sampel yang berisi media RV diinkubasi pada suhu 42° C ± 0,2 °C selama 24 jam±2 jam dan pada sampel yang berisi media TT Broth diinkubasi pada suhu 43 °C±0,2 °C selama 24 jam±2 jam. Sampel dengan dugaan cemaran bakteri Salmonella sp. rendah low microbial load, sampel yang berisi media RV diinkubasi pada suhu 42 °C±0,2 °C selama 24 jam±2 jam, dan sampel yang berisi media TT Broth diinkubasi pada suhu 35 °C±2,0 °C selama 24 jam±2 jam. Uji bakteri Salmonella sp. Sampel pada media pengayaan RV dan TT Broth dihomogenkan, kemudian sampel dalam media pengayaan TT Broth distreak digores dengan menggunakan jarum inokulasi pada media Bismuth Sulfite BS Agar Lampiran 13, Xylose Lysine Desoxycholate XLD Agar Lampiran 20 dan Hectoen Enteric HE Agar Lampiran 14. Metode tersebut diulangi lagi untuk sampel dalam media pengayaan RV. Selanjutnya media Bismuth Sulfite BS Agar, Xylose Lysine Desoxycholate XLD Agar dan Hectoen Enteric HE Agar yang telah distreak masing – masing dengan sampel dalam media pengayaan RV dan TT Broth, diinkubasi pada suhu 35 °C selama 24 jam ±2 jam. Tipe morfologi koloni bakteri Salmonella sp. Tipe morfologi koloni bakteri Salmonella sp. yaitu sebagai berikut: a koloni bakteri pada cawan media Bismuth Sulfite BS Agar berwarna coklat, keabuan atau kehitaman, terkadang metalik. Di sekitar koloni bakteri berwarna coklat, namun semakin lama waktu inkubasi koloni tersebut akan berubah menjadi warna hitam, hasil tersebut dinamakan halo effect. b koloni bakteri pada cawan media Xylose Lysine Desoxycholate XLD Agar berwarna merah muda dengan atau tanpa bintik hitam. c koloni bakteri pada cawan Hectoen Enteric HE Agar berwarna biru kehijauan, biru dengan atau tanpa titik hitam. Hasil koloni bakteri yang terlihat pada cawan BS agar setelah diinkubasi selama 24 jam±2 jam pada suhu 35 o C, selanjutnya diinokulasi ke media miring Triple Sugar Iron TSI Agar Lampiran 15 dan Lysine Iron Agar LIA Lampiran 16 dengan cara menusuk ke dasar media dan juga digores pada media miring tersebut dan diinkubasi selama 24 jam±2 jam pada suhu 35 °C. Koloni bakteri Salmonella sp. pada media TSI Agar, menghasilkan koloni bakteri berwarna merah reaksi basa pada media miring TSI Agar dan koloni bakteri berwarna kuning pada dasar tabung reaksi asam dengan atau tanpa memproduksi H 2 S bertanda warna kehitaman pada media TSI Agar tersebut. Koloni bakteri Salmonella sp. pada media LIA, menghasilkan warna ungu adanya reaksi basa pada dasar tabung media dan koloni bakteri warna kuning adanya reaksi asam pada dasar tabung media tersebut menandakan terjadi reaksi asam negatif. Beberapa bakteri Salmonella sp. memproduksi H 2 e Pengujian bakteri Staphylococcus sp. Bacteriological Analytical Manual BAM 2009 S pada media LIA. Sampel ditimbang sebanyak 50 g dan dimasukkan dalam wadah steril. Selanjutnya ditambahkan 450 mL Butterfield’s phosphate-buffered water steril dan dihomogenkan dengan stomacher selama 1-2 menit. Larutan tersebut sebagai pengenceran 10 -1 . Selanjutnya dari larutan pengenceran 10 -1 diambil sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam larutan Butterfield’s phosphate-buffered water steril sebanyak 9 mL dan dihomogenkan. Larutan tersebut sebagai larutan dengan pengenceran 10 -2 . Metode yang sama dibuat untuk pengenceran 10 -3 Pengujian dengan media Baird Parker Agar BPA atau sampai pada pengenceran yang dikehendaki. Media yang digunakan pada pengujian ini adalah Baird Parker Agar BPA Lampiran 17. Media BPA sebanyak 58 gr dilarutkan ke dalam aquades 950 mL yang telah ditambahkan egg yolk tellurite emulsion sebanyak 50 mL Lampiran 18 dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan tersebut dituang pada cawan steril sebanyak 15-20 mL dan didiamkan sampai media pada cawan tersebut menjadi padat. Diambil 1 mL sampel larutan pengenceran yang diperlukan 10 -1 -10 -3 Larutan sampel yang telah terserap pada cawan tersebut, kemudian diinkubasi pada suhu 35 ke atas permukaan media padat BPA dan diratakan dengan menggunakan hockey stick. Cawan tersebut didiamkan sampai sampel larutan terserap. o C selama 45-48 jam dengan posisi cawan terbalik. Diseleksi cawan tersebut yang mengandung jumlah koloni bakteri yaitu 20-200 koloni. Untuk koloni bakteri S. aureus memiliki ciri koloni bakteri berbentuk bundar, halus, cembung dengan diameter 2-3 mm di permukaan media, berwarna keabuan sampai hitam pekat, terkadang dengan zona terang off-white di sekelilingnya zona opak dengan atau tanpa zona terang clear zone. f Pengujian kapangkhamir Bacteriological Analytical Manual BAM 2009 Sampel ditimbang sebanyak 50 g dan dimasukkan ke dalam wadah steril kemudian ditambahkan 450 mL larutan Buffer Peptone Water BPW 0,1 steril dan dihomogenkan dengan stomacher selama 2 menit. Homogenat tersebut sebagai sampel dengan larutan pengenceran 10 -1 . Selanjutnya dipipet 1 mL larutan pengenceran 10 -1 dan dimasukkan ke dalam 9 mL Buffer Peptone Water BPW 0,1 steril untuk memperoleh larutan pengenceran 10 -2 . Dengan metode yang sama tersebut, dilakukan untuk memperoleh larutan dengan pengenceran 10 -3 sampai dengan larutan pengenceran 10 -5 Sampel dari larutan pengenceran 10 . -1 -10 -5 dipipet sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam cawan steril. Dilakukan secara duplo untuk setiap sampel larutan pengenceran. Selanjutnya ditambahkan media Potato Dextros Agar PDA steril Lampiran 19 yang telah ditambahkan asam tartarat 10 yaitu 12-15 mL yang telah didinginkan suhu 45±1 o C ke dalam masing – masing cawan steril yang sudah berisi sampel larutan pengenceran tersebut. Dilakukan gerakan cawan membentuk angka delapan agar media dalam cawan tersebut tersebar merata. Media dalam cawan tersebut didiamkan sampai padat dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 35 o

3.4.3 Analisis proksimat

C selama 48 jam±2 jam dengan posisi cawan terbalik. Setelah diinkubasi koloni kapangkhamir dapat dihitung seperti pada penghitungan total koloni mikroba. a Analisis kadar air Association of Official Analitical Chemist AOAC 2005 Analisis kadar air dilakukan menggunakan metode oven. Cawan kosong dikeringkan dalam oven suhu 100-102 o C selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator sampai mencapai suhu ruang dan ditimbang A. Sampel sebanyak 5 g diletakkan pada cawan tersebut B. Cawan yang berisi sampel dikeringkan ke