95 : 5 vv. Setelah dielusi, lempeng KLT tersebut dibiarkan mengering secara aseptis.
h. Metode bioautografi kontak
Lempeng KLT yang telah kering tersebut, dikontakkan pada media agar yang telah diinokulasikan 100 µL bakteri uji secara
spreading. Setelah 40 menit, lempeng KLT tersebut diangkat dari media agar dan media agar tersebut diinkubasi selama 18 jam yang kemudian
diamati lokasi bercak yang mengandung daya antibakteri. Daya antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona hambat pada media agar
tersebut Choma, dan Grzelak, 2010.
7. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak rimpang kunyit
a. Preparasi pereaksi -carotene
Pereaksi -carotene dibuat 0,05 bv dalam pelarut kloroform
dan disimpan dalam wadah gelap dan tertutup rapat Marston, 2011. b.
Optimasi intensitas cahaya Lempeng KLT kosong dicelupkan dalam pereaksi
-carotene yang telah dibuat sebelumnya dan warna lempeng KLT tersebut diukur
dengan menggunakan indikator warna. Lempeng KLT kemudian disinari dengan lampu UV dalam kotak
fluoroscent, dimana posisi ketinggian lampu UV diatur yaitu 100 cm dari dasar, 50 cm dari dasar, dan 35 cm
dari dasar serta intensitas cahaya pada tiap ketinggian diukur dengan alat light meter. Perubahan warna yang terjadi pada latar lempeng KLT
tersebut diamati pada menit ke – 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15. Tiap posisi
lampu tersebut dilakukan dengan 5 kali replikasi dan dihitung standar deviasi serta rata
– rata perubahan warnanya. c.
Uji kualitatif aktivitas -carotene Larutan ekstrak dengan konsentrasi 5 mg mL yang telah
disiapkan ditotolkan pada lempeng KLT untuk dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol 95 : 5 vv. Lempeng
KLT yang telah dielusi kemudian dicelupkan dengan pereaksi -carotene
dan warna pada lempeng KLT tersebut diukur dengan menggunakan indikator warna. Setelah itu, lempeng KLT tersebut disinari dengan sinar
UV dalam kotak fluoroscent dengan ketinggian lampu dari dasar adalah
50 cm dan intensitas cahayanya telah terukur dengan alat light meter.
Perubahan warna pada lempeng KLT diukur pada menit ke – 0, 1, 3, 6, 9,
12, dan 15. Uji ini dilakukan dengan 5 kali replikasi dan dihitung standar deviasi serta rata
– rata perubahan warna.
8. Isolasi senyawa yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas,
antibakteri, dan UV protection
a. Triturasi
1 Penyiapan sampel
Ekstrak kental ditimbang 5,0 gram dan dimasukkan ke dalam mortir yang telah ditimbang sebelumnya. Lima gram
sea sand ditambahkan pada mortir tersebut dan diaduk hingga homogen
sambil diteteskan metanol sebanyak 1 – 2 tetes untuk memudahkan
pengadukan. Campuran tersebut kemudian didiamkan selama semalam di dalam lemari pendingin.
2 Triturasi dengan n-heksan
Campuran ekstrak kental rimpang kunyit dan sea sand
tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge. Lima
mL n-heksan ditambahkan pada tabung sentrifuge tersebut,
dicampurkan hingga homogen dengan vortex, dan kemudian disentrifugasi. Bagian larutan hasil dari sentrifugasi tersebut
kemudian diambil dan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatmann no. 42 yang akan ditampung di cawan porselen yang
telah ditimbang sebelumnya. Langkah ini dilakukan hingga bagian larutan
hasil sentrifugasi menjadi bening. Hasil filtrasi tersebut kemudian diuapkan di atas penangas air hingga seluruh pelarut
teruapkan dan ditimbang kembali. Filtrat yang diperoleh disimpan di lemari pendingin dan disebut sebagai hasil triturasi n-heksan.
3 Triturasi dengan kloroform : metanol 95:5 vv
Campuran ekstrak kental rimpang kunyit dan sea sand sisa
dari triturasi n-heksan dikeringkan dan dipindahkan ke tabung sentrifuge baru. Kloroform : metanol 95:5 vv ditambahkan
sebanyak 5 mL, dicampurkan hingga homogen dengan vortex, dan kemudian disentrifugasi. Bagian larutan
hasil dari sentrifugasi tersebut kemudian diambil dan disaring dengan menggunakan kertas
saring Whatmann no. 42 yang akan ditampung di cawan porselen
yang telah ditimbang sebelumnya. Langkah ini dilakukan hingga bagian larutan
hasil sentrifugasi menjadi bening. Hasil filtrasi tersebut kemudian diuapkan di atas penangas air hingga seluruh
pelarut teruapkan dan ditimbang kembali. Filtrat yang diperoleh disimpan di lemari pendingin dan disebut sebagai hasil triturasi
kloroform : metanol 95:5 vv. 4
Pengujian KLT ekstrak kental dan hasil triturasi Masing
– masing ekstrak kental rimpang kunyit, hasil triturasi n-heksan, dan hasil triturasi kloroform : metanol 95:5 vv
ditimbang 2,5 mg yang kemudian diletakkan pada masing – masing
tabung flakon. Masing – masing tabung flakon tersebut kemudian
ditambahkan 500 µL etanol p.a dan diaduk hingga homogen. Setelah terlarut hingga homogen, masing
– masing tabung flakon tersebut ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan mikrokapiler
dengan jarak elusi 5 cm dan fase gerak kloroform : metanol 95 : 5 vv. Hasil elusi dibandingkan dan dihitung nilai Rf masing
– masing bercak pada ekstak kental rimpang kunyit, hasil triturasi n-heksan,
dan hasil triturasi kloroform : metanol 95:5 vv. b.
Kromatografi kolom Kromatografi kolom pada penelitian ini menggunakan metode
elusi step
– gradient chromatography.
1 Optimasi pelarut yang akan digunakan
Hasil triturasi n-heksan yang telah diperoleh tersebut ditimbang 2,5 mg dan dilarutkan dalam 0,5 mL n-heksan hingga
tercampur homogen. Campuran tersebut kemudian ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 5 cm untuk masing
– masing fase gerak. Fase gerak yang digunakan yaitu: n-heksan : kloroform 50:50
vv, n-heksan : kloroform 25:75 vv, kloroform, dan kloroform : metanol 98:2 vv. Setelah dielusi, lempeng KLT tersebut kemudian
diamati dan dibandingkan setiap fase gerak. 2
Preparasi sampel untuk kromatografi kolom Hasil triturasi n-heksan ditimbang 300 mg dan
dicampurkan dengan 300 mg silika gel 60 0,040 – 0,063 mm
hingga homogen. 3
Penyiapan kolom kromatografi Bagian bawah kolom disumbat dengan kapas yang telah
dibasahi dengan n-heksan. Kolom kemudian disusun dari bawah ke atas yaitu: silika gel 60 0,040
– 0,063 mm di atas kapas tersebut dengan ketinggian sekitar 2 cm, sampel yang telah tercampur dengan
silika gel 60 0,040 – 0,063 mm dengan ketinggian sekitar 0,5 cm,
silika gel 60 0,040 – 0,063 mm dengan ketinggian sekitar 1 cm,
dan ditutup kembali dengan kapas yang telah terbasahi oleh n- heksan.
4 Kromatografi kolom dengan teknik elusi step - gradient
Kolom kromatografi yang telah siap digunakan dialirkan dengan 20 mL n-heksan : kloroform 75:25 vv dan dilanjutkan
dengan 10 mL n-heksan : kloroform 50:50 vv yang ditampung dalam tabung flakon setiap 2 mL dari hasil kromatografi kolom
tersebut. Setiap tabung flakon tersebut kemudian dicuplik untuk dilakukan KLT dengan menggunakan fase gerak kloroform dan
profil KLT tersebut diamati. 5
Penggabungan isolat hasil kromatografi kolom Nilai Rf masing
– masing plat KLT hasil cuplikan tiap tabung flakon dari kromatografi kolom dihitung. Bercak yang
memiliki nilai Rf yang sama dan pada profil KLT hanya menunjukkan satu bercak digabungkan dalam wadah tabung flakon
lain yang telah ditimbang sebelumnya. Setelah itu, diuapkan di atas penangas air dengan suhu 50
dan ditimbang kembali untuk mengetahui bobot yang didapatkan serta dihitung pula rendemen
yang diperoleh. Ketika hasil penggabungan isolasi tersebut telah pekat, maka langkah selanjutnya adalah memindahkannya ke tabung
eppendorf dengan cara melarutkan isolat dengan pelarut yang sesuai sehingga diperoleh kadar 1 mg 100 µL dan kemudian diuapkan
kembali, sehingga di dalam tabung eppendorf terdapat 1 mg isolat.
9. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection pada
