21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
c. Pemisahan dan Pemurnian Depkes RI, 2000
Tujuannya adalah untuk menghilangkan senyawa yang ridak dikehendaki semaksimal mungkin tanpa pengaruh pada senyawa kandungan yang dikehendaki,
sehingga diperoleh ekstrak yang lebih murni. Proses-proses pada tahap ini adalah pengendapan, pemisahan dua cairan tak bercampur, sentrifugasi, dekantasi,
filtrasi, serta poses absropsi dua penukar ion.
d. Pemekatanpenguapan Depkes RI, 2000
Pemekatan berarti peningkatan jumlah partikel solut senywat terlarut dengan cara penguapan pelarut tanpa sampai menjadi kering tetapi ekstrak hanya
menjadi kentalpekat.
2.7 ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay
ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay merupakan suatu tes yang
cepat untuk menditeksi dan kuantifikasi antibodi atau antigen against viruses, bakteri, dan bahan lainnya. Metode ini dapat digunakan untuk menditeksi infeksi
yang memiliki efek poultry dan livestock Idexx, 1986. Teknologi ELISA menggunakan fase padat yang mengandung plat
polistiren 96-well, walaupun penggunaan bahan lain dapat digunakan. Kegunaan fase padat untuk imobilisasi antigen atau antibodi pada sampel dimana keduanya
dapat terikat pada fase padat. Setelah inkubasi, plate dicuci untuk menghilangkan bahan yang tidak berikatan. Pada beberapa assay konjugat ditambahkan ke dalam
plate dan diperbolehkan untuk diinkubasi Idexx, 1986. Konjugat mengandung antigen atau antibodi yang telah diikat dengan
enzim. Pengikatan konjugat degan fase padat atau sampel tergantung pada format assay. Bagian enzim pada konjugat dapat diditeksi. Plate dicuci kembali dan
substrat enzim hidrogen peroksida dan kromogen ditambahkan dan diperbolehkan untuk dinkubasi. Warna akan terlihat pada ikatan enzim dan
densitas optik dibaca dengan ELISA plate reader Idexx, 1986. Prinsip-prinsip ELISA yaitu Walker, 2008:
a. Penempelan protein terhadap plastics secara pasif. b. Membersihkan protein yang tidak berikatan.
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
c. Penambahan antibodi spesifik untuk berikatan dengan enzim pada beberapa tahap.
d. Penggunaan competing inert protein untuk pencegahan reaksi nonspesifik dengan plastics.
e. Tahap pencucian untuk memisahkan reagen yang berikatan dengan yang tidak berikatan.
f. Penambahan substrat spesifik yang memberikan perubahan warna dengan katalis enzim atau substrat dan colorless chromophore larutan pewarna
yang menunjukan pembentukan warna pada katalis enzim. g. Tahap inkubasi untuk proses reaksi imunologi.
h. Pemberhentiaan katalis enzim. i.
Pembacaan warna dengan spektrofotometer ELISA terdiri dari tiga sistem yaitu direct ELISA, inderect ELISA,dan
sandwich ELISA. Semua sistem ini dapat digunakan untuk memperlihatkan kompetisi pengahambatan ELISA Walker, 2008. Tahap-tahap masing-masing
sistem ELISA yaitu:
a. Direct ELISA Crowter, 2009
1. Antigen ditambahkan pada fase padat dan adsorbsi secara pasif pada saat inkubasi.
2. Setelah inkubasi, antigen yan tidak berikatan dibersihkan dari fase padat. 3. Spesifik antibodi ditambahkan untuk antigen dan berikatan dengan enzim
konjugat dan inkubasi. 4. Ikatan konjugasi dengan antigen pada fase padat. Kemudian konjugat
yang tidak berikatan dibersihkan. 5. Substrat atau larutan kromofor dan reaksi katalis enzim ditambahkan
untuk memberikan produk yang berwarna. Reaksi diakhiri pada waktu yang tepat dan kuantifikasi warna dibaca menggunakan spektrofotmeter.
b. Indirect ELISA Walker, 2008
1. Lapiskan wells dengan antigen kemudian diinkubasi. 2. Wells dibersihkan untuk menghilangkan antigen yang tidak berikatan.
3. Antibodi yang berlawanan dengan antigen ditambahkan dan kemudian diinkubasikan.
Kategori